ELISA实验中常见出现问题及解决办法（一）
ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。除了盒子本身质量外，操作中很多因素都影响试验的正常结果。*常出现的问题是显色淡，灵敏度偏低、重复性不佳、假阳性结果和假阴性结果，不管出现什么样的结果，不但浪费客户的金钱、样本、精力，更重要的是对临床做出了危险判断。在这里我们分析ELISA试验非正常检测结果产生的常见原因，并探讨其解决办法，以提高检测质量。
一、显色淡，灵敏度偏低
1.试剂盒在运输途中时间太长，温度太高；所以尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温。
2.试剂盒未充分平衡；所以试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃）。
3.培养箱温度不足37℃，应注意培养箱温度，放入反应板后尽量减少开启次数以免影响温度恒定，非隔水式培养箱尤其应注意。
4.保温时间不足；所以做实验时一定注意时间的重要性，如果怕忘了时间，可以校正定时钟准确定时。
5.洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长、洗涤次数增加；按说明书要求保留洗涤时间，准确记住洗涤次数。
6.移液器吸液量不足，吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁；所以保证校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密，吸嘴内壁要清洁，一次性使用。
7.蒸馏水水质有问题，要使用新鲜合格的蒸馏水。
二、重复性较差，经常有客户反馈说做了两个复孔值相差太大。可能的问题有：
1.样品数量多少不一，加样时间有长有短；所以重复某一样品时，加样时间尽可能接近。
2.保温时间不一致，洗涤条件不一致，操作人员不一致；重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性。
3.加样量不一致；样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴。
三、假阳性结果和假阴性结果
1.标本的采集与保存
1.1当标本采集保存不当产生溶血时，红细胞中的血红蛋白释放到血清中，血红蛋白具有过氧化物酶的性质，其通过吸附或“PP效应”（蛋白质间相互吸附的现象）结合后，可催化A、B液显色而造成假阳性
1.2标本采集保存不当致细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，会产生假阳性反应；标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG聚合，易使间接法的试验本底加深。因此，标本宜在新鲜时检测。
1.3反复冻融血清会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存做多次检测，宜少量分装冻存。
2.加样
2.1 如果 样品稀释液少加或血清多加，都会引起本底增高。对于间接法来说，受上述两个因素影响更大。因为血清中受检的特异性IgG只占IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异性IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。这些非特异性的IgG均可以和酶标二抗发生反应而造成较高阴性本底或假阳性。如果加入的血清过多，高于规定的稀释倍数，极易造成高值阴性。反之，造成假阴性。
2.2 如果加入的酶结合物过多或加在较高的孔壁上或孔口，也会引起本底升高或假阳性。
2.3 如果血液未开始凝固或凝固不完全时就强行离心分离血清，此时的血清中仍留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果。
