1. 人工海藻糖酶多肽片段的合成和重组海藻糖酶的制备

　　国外采用标准9-甲氧羰基荧光素固相合成法合成氨基酸残基序列291-307肽段(SKDVEIADT[~PEGDREA)。用反相高效液相色谱法（HPLC）分析并提纯多肽。HPLC主要是根据分子的亲水性（反相）和电荷（离子交换）方面的差别来实现样品的分离的。反相HPLC的优点是分辨率大。利用分子生物学方法表达出的重组人海藻糖酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化后也可以作为一种免疫原。

　　2. 抗海藻糖酶单克隆抗体的制备

　　通过腹腔注射加佐剂的重组蛋白或合成的多肽来免疫8周龄的雌性小鼠BALB/c，第一次免疫问隔两周后，每周连续注射3-4次。最后一次注射后3-4天杀死小鼠，用改良的Kohler和Milstein方法将脾细胞与B细胞瘤株P3-X63-Ag8融合。细胞融合产生8种杂交瘤克隆株：KM2275、KM2276、KM2285-2290，单克隆抗体KM2275和KM2276是由重组海藻糖酶免疫产生的抗体，其他抗体是由合成多肽免疫产生的。抗体KM2275和KM2287与重组海藻糖酶和尿液中的海藻糖酶均有良好反应。

　　3. 夹心ELISA方法的建立

　　用单克隆抗体KM2287包被ELISA反应板小孔，用生物素标记单克隆抗体KM2275，用HRP标记链霉亲和索，采用生物素一亲和素夹心酶免疫测定办法；lshiharaR等测定了该方法的最适工作条件：尿液标本测定前需经凝胶过滤；尿液过滤后需用含1g/LSDS的PBS稀释10倍；最适pH为6.0-8.0。当尿液贮存于-60℃、-30℃、或4℃30天，酶蛋白含量均未下降。可能影响的物质如维生素C（10g/L）、葡萄糖（100g/L）、白蛋白（10g/L）或肌酐（1g/L）均不影响该ELISA方法。