血凝及血凝抑制实验的实验内容及操作方法
实验内容及操作方法
(一)血球凝集(HA)试验
1. 在96孔微量反应板上进行,自左至右各孔加50 uL生理盐水。
2. 于左侧第1孔加50 uL病毒液(尿囊液或冻干疫苗液),混合均匀后,吸50 uL至第2孔,依次倍比稀释至第11孔,吸弃50 uL;第12孔为红细胞对照。
3. 自右至左依次向各孔加入0.5%鸡红细胞悬液50 uL,在振荡器上振荡,室温下静置后观察结果(表4-1)。
表4-1 病毒血凝试验的操作方法(单位:uL)
孔 号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
病毒稀释度 | 1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:32 | 1:64 | 1:128 | 1:256 | 1:512 | 1:1024 | 1:2048 | 对照 |
生理盐水 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
病毒液 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | |
0.5%红细胞 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
弃50 | ||||||||||||
结果观察 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | +++ | + | + | - | - |
4. 结果判定:从静置后10 min开始观察结果,待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集,沉于孔底,平铺呈网状,即为100% 凝集(++++),不凝集者(-)红细胞沉于孔底呈点状。
以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价,即为一个凝集单位。从表4-1看出,该新城疫病毒液的血凝价为1:128,则l:128为1个血凝单位,1:64、l:32分别为2、4个血凝单位,或将128/4=32,即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。
(二) 血球凝集抑制(HI)试验
1. 根据HA试验结果,确定病毒的血凝价,配制出4个血凝单位的病毒液。
2. 在96孔微量反应板上进行,用固定病毒稀释血清的方法,自第1孔至第11孔各加50 uL生理盐水。
3. 第1孔加被检鸡血清50 uL,吹吸混合均匀,吸50 uL至第2孔,依此倍比稀释至第10孔,吸弃50 uL,稀释度分别为:1:2、1:4、1:8 …… ;第12孔加新城疫阳性血清50 uL,作为血清对照。
4. 自第1孔至12孔各加50 uL 4个血凝单位的新城疫病毒液,其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照,振荡混合均匀,置室温中作用10min 。
5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50 uL,振荡混合均匀,室温下静置后观察结果(表4-2)。
表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法(单位:mL)
孔 号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
血清稀释度 | 1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:32 | 1:64 | 1:128 | 1:256 | 1:512 | 1:1024 | 病毒 对照 | 血清 对照 |
生理盐水 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | |
被检鸡血清 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | |
4单位病毒 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
室温中静置 10 min | ||||||||||||
0.5%红细胞 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
弃去50 | ||||||||||||
结果观察 | - | - | - | - | - | - | + | ++ | +++ | ++++ | ++++ | - |
6. 结果判定:待病毒对照孔(第11孔)出现红细胞100%凝集(++++),而血清对照孔(第12孔)为完全不凝集(-)时,即可进行结果观察。
以100%抑制凝集(完全不凝集)的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价,即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者,该病毒为新城疫病毒。
从表4-2看出,该血清的HI效价为1:64,用以2为底的负对数(-log2)表示,即6log2。