食品中沙门氏菌检测方法的研究进展
0引言自19世纪后期,沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种病原以来,检测方法学都是建立在采取感染病人的粪便或血液作为临床病料的基础上。此后的60年间,用于从食品中分离沙门氏菌的方法实质上与那些用于临床病料的方法是相同的。但由于沙门氏菌在污染食品中含量较低以及食品对检测的干扰给沙门氏菌的检测带来了一定的困难,同时食品加工过程中的诸多因素的作用,使沙门氏菌受到了亚致死性的损伤或称“致伤”。这就形成了一个具有不同生长特性的细菌群。因此在选择培养基上直接培养“致伤”的沙门氏菌通常是以细菌死亡和试验失败而告终。随着DNA和抗体技术的发展,近20年间出现了很多改进的方法,其中许多方法可以在48h内检出沙门氏菌。本文对目前已经发展成熟的检测方法做了系统的比较和综述,旨在为今后该方法的研究应用提供一定的参考。1传统的培养方法(国标法)用于沙门氏菌分析的传统方法是食物样品分步增菌,以增加病原的可检出率,这种培养方法总体可分3个不同阶段或步骤。第一步(预增菌),将样品加到缓冲蛋白胨水中,进行前增菌,对未加工食品无需前增菌。然后接到MM培养基或SC培养基上。第二,是选择性增菌步骤,目前应用的主要有如下2种类型:亚硫酸铋琼脂平板、DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS琼脂平板或SS琼脂平板)。由于没有任何一种培养基可以全面地保持所有食品基质或各种沙门氏菌血清型,所以,较适当的做法就是使用两种培养基平行地进行试验。第三步是分离步骤,即选择性培养物在含一种或多种抑制非沙门氏菌生长制剂的琼脂平板上划线培养,然后对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认,并对该菌落分离物进行一系列生化试验和血清学检测,以作出鉴定。传统沙门氏菌检测法全过程需时至少4～7d,才能得出明确的诊断结果。2以抗体为基础的检测方法利用抗原-抗体反应的特异性,来进行细菌的鉴别和血清学定型,已有半个多世纪的历史。根据沙门氏菌菌体或鞭毛抗原的存在,建立的沙门氏菌免疫学检测方法有许多种,大致可分为以酶标抗体(ELISA),荧光抗体染色(免疫荧光法),同位素标记抗体(放射免疫试验)为基础的方法及其它多种以抗体为基础,利用乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散及免疫色谱技术等方法。下面以ELISA法和免疫荧光标记来进行介绍。2.1ELISA法黎兆滚等[1]首次在国内口岸系统应用微量板ELISA法(Salmonelle test1)对进出口动物产品(鱼粉、肉骨粉等)进行沙门氏菌检测。该法采用预先包被了沙门氏菌(A-E群)单克隆抗体的微量板,加入经增菌处理的样品,反应后再加入一定的指示剂,作用后用酶标仪测定OD值来判定结果。食物样品经适当的增菌处理,也可用此法进行沙门氏菌检测。ELISA法检出沙门氏菌的极限范围在105～106mL-1,因此,要得出可靠的结果,食物样品首先要进行预增菌、选择性增菌,通常还要在含有D-甘露醇的肉汤中进行后增菌,以促进鞭毛发育。总的来说,标准的ELISA法样品的制备,约需要经过40～48h的孵育才能完成。黎兆滚等人的微量板ELISA法(Salmonella test1)样品制备过程分三步,共耗时24h。比上述标准的ELISA法样品制备过程缩短了一半的时间。ELISA方法本身,则仅需要大约2h而已(其中30min是操作时间,90min是孵育时间)。相比之下,黎兆滚等人的方法可在26h内完成,比上述方法缩短了一半的时间,值得推广应用。2.2免疫荧光标记最新式的沙门氏菌免疫学检测法,利用经特异性抗体敏化的免疫色谱卡片为基础。将几滴样品加到卡片上,结果可以直接用肉眼读出。免疫色谱卡片极易操作,且由于不需要特殊设备,很适合小型实验室使用。尽管卡片检测法与ELISA法一样需要对样品进行增菌处理,但其(卡片法)本身通常需时不超过10min,如果采用黎兆滚等人的样品制备法,则可使操作时间缩短。用荧光素标记已知抗原(或抗体),与特异抗体(或抗原)结合后产生荧光。孙洋[2]等人利用吖啶橙标记免疫血清,用吖啶橙免疫荧光菌团培养法检测沙门氏菌,证明该检测方法对于34mL-1的沙门氏菌均可检出,与枯草杆菌,大肠埃希氏杆菌等八种杂菌均不形成菌团交叉,与杂菌的浓度比在1︰640之内均不受干扰,在30h内即可获得结果。缩短了检测时间,而且具有敏感性高,特异性强,简便快速等优点。Cloak等[3]利用表面吸附将检测样品吸附于载于玻璃斜面的一种薄膜上,然后用免疫荧光显微镜进行结果判定。该方法对沙门氏菌可检测到103.5mL-1,而不出现假阴性和假阳性反应。Kyrinrki和Heimarch[4]用荧光抗体检测系统检测食品中的沙门氏菌,该系统中有一个直径47mm的薄膜滤器,在滤器上可同时检测14个样品。除采用免疫荧光标记方法检测,Pontello等在第五届国际快诊会议上还报导了一种利用Mucap荧光试验检测沙门氏菌中的辛脂酶进行快速诊断的方法,其原理是根据沙门氏菌含有的辛脂酶具有水解辛脂的作用而设计的。由底物Mucap试验检测沙门氏菌中的8碳辛脂酶,酶作用于辛脂结合的4-甲基伞形酮,在波长365nm照射下,萌发很强的荧光,这一特性为沙门氏菌所特有,沙门氏菌水解Mucap呈现可见荧光的过程只需数分钟,操作简便,不需要特殊仪器设备(假钞识别机即可满足需要),更适用于基层推广使用。Raiz(1992)[5]对9628份粪样分离的8634个菌落进行Mucap试验研究表明敏感性为100%,特异性为99.8%。Muroz等(1993)[6]报道的试验结果其敏感性也为100%。由于该法敏感性高,特异性强,易于操作,使之特别适用于广大基层每年大量食品行业从业人员体检以及食品卫生细菌的检验,并有望替代当前的多项生化反应鉴定而作为实验室常规过筛方法[7]。3以核酸为基础的方法所有的细胞都含有DNA和RNA这样唯一一类可携带信息的大分子,一般用它作为检测的标靶。标靶通常是一个特异性核酸序列,它可通过以补体核酸分子作为探针来检出。探针需要加附适当的标记,此法应用的探针含有放射性同位素标记的伤寒沙门氏菌DNA片段,其敏感性高,经约48h的增菌步骤后,检测极限可达108mL-1。目前,以核酸杂交为基础的第二代技术-比色计目前也已发展起来,此法依赖于沙门氏菌核糖体RNA(rRNA)-核糖体发育过程中储存的核酸成分的检测。核糖体是细胞蛋白质合成器的一部分,每个细菌细胞中存在5000～20000个复制体,而相比之下染色体DNA复制体仅2～10个。这种天然富含rRNA标靶序列的情况使得用无辐射计检测成为可能,同时又保持了与放射性同位素方法相当或更高的敏感性。目前常用的PCR法。PCR技术因具有简便、快速、敏感性高和特异性强的优点,现已广泛应用于微生物检测、遗传病诊断等诸多领域。自Rahn等[8]首先利用invA基因设计出一对引物,用PCR检测沙门氏菌以来,国内外的许多学者进行了利用PCR技术检测沙门氏菌的研究,并研制成适合临床应用的检测试剂盒。如Cocoin L等[9]用沙门氏菌invA基因寡聚核苷酸设计了一对引物进行沙门氏菌检测,其中被检的75份样品13份呈阳性反应,与传统检测方法一致,从而证明了PCR为一种有效的检测食品中鼠伤寒沙门氏菌的快检方法;黄金林、焦新安等[10]根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因序列设计引物序列,成功扩增出495bp的沙门氏菌特异条带,而阴性对照则无此条带,从而建立了应用PCR进行沙门氏菌快速检测的方法,并研制成适合临床应用的检测试剂盒,通过对粪便、水、饲料、畜产品等样品的沙门氏菌检测,与传统检测方法的特异性和敏感性一致;江树勋等[11]应用PCR扩增invA基因检测致病性沙门氏菌,并测定其PCR检测灵敏度。结果显示,扩增出的284bp大小的序列为目的条带,实验可检出的最小灵敏度为11.542pg。刘佩红等[12]利用PCR技术,对上海地区的174份鸡蛋、580份原料牛奶、253份猪肉、248份牛肉和58份虾仁样品进行了沙门氏菌检测。与国标法对比,PCR法的敏感性和特异性均为100%。此外,用于沙门氏菌检测的PCR技术还有ER-ICPCR,M-PCR[13],BAX-PCR[14]系统等检测方法。PCR技术以其敏感性、特异性、简便、快速的优点,现已广泛应用于微生物检测,尤其对培养困难的细菌检测和抗原结构复杂的细菌鉴定方面,具有常规方法无法比拟的优越性。4用于沙门氏菌检测的其它方法4.1电阻抗测定法电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术,已经开始应用于食品微生物的检验。其原理是细菌在培养基内生长繁殖的过程中,将会使培养基中的大分子电惰性物质如碳水化合物、蛋白质和脂类等,代谢为具有电活性的小分子物质,如乳酸盐、醋酸盐等,这些离子态物质能增加培养基的导电性,使培养基的阻抗发生变化,通过检测培养基的电阻抗变化情况,?判定细菌在培养基中的生长繁殖特性,即可检测出相应的细菌。因为具有检测速度快、灵敏度高、准确性好等优点,阻抗微生物学在食品工业中得到了广泛的应用,主要体现在食品微生物质量控制的许多领域,诸如原料质量估测、加工工艺评估、成品质量检测、产品货架期预测等。该法目前已经用于细菌总数、霉菌、酵母菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等的检测。Quinn[15]等分别用传统培养技术与3?种快速检测方法(阻抗法、基因探针法和沙门氏菌示踪法)对禽类饲料和环境样品中的沙门氏菌进行检测,39.2%的样品为阳性。阻抗法检测为38.4%,传统培养法检测为25.5%,基因探针法检测为28.9%,沙门氏菌示踪法检测为28.5%。阻抗法是几种方法中最少受到主观因素干扰的。Pless等分别用阻抗法和传统检测方法进行对照试验,对250种食品样品进行了检测。在122种沙门氏菌阳性样品中,用阻抗方法检出的有119种,传统的亚硒酸盐-胱氨酸培养基检出106种,用RV培养基仅检出92种。4.2颜色测定法以选择性培养基为基础,经过改良,使目标菌在培养基上的菌落显示出一定颜色,便于识别。其原理是利用细菌特有生理生化反应,使培养基中指示剂产生颜色变化,以将目标菌与其他菌区分[16]。其操作简便,即将食品样品增菌后直接划平板,置37℃培养18～24h,取出并观察培养皿上生长菌落的颜色。4.3增菌血清学方法血清学鉴定在对检测菌株进行血清学鉴定时,应注意沙门氏菌抗原并非沙门氏菌所特有,己知弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌的许多抗原与沙门氏菌的抗原完全或部分相同,所以,当检测畜产品的培养物中的菌株能与沙门氏菌因子血清或多价血清发生凝集反应时,并不能认定为沙门氏菌。同样,vi抗原也在弗氏柠檬酸杆菌中大量存在。因此,必须结合生化反应结果作出综合判定。4.4微量热量测定法微热量计技术[17](Microcalorimetry)是通过测定细菌生长时热量的变化进行细菌的检出和鉴别。微生物在生长过程中产生热量,虽然产生的量很小,但仍能通过敏感的微热量计进行测量。用微热量计对微生物计数时,温谱图必须与绝对微生物细胞数呈相关性,一旦建立了参考温谱图,食品样品温谱图便可与之相比较而得到微生物的绝对数量。4.5生物发光法生物学发光检测法[18],利用细菌细胞裂解时会释放出ATP,ATP自细菌细胞释放出来后,使用荧光虫素和荧光虫素酶可使之释放出能量,这些能量产生磷光,光的强度就代表ATP的量,从而推断出菌落总数。美国NHD公司推出ATP食品细菌快速检测系统的Profile-13560通过底部有筛孔的比色杯将非细菌细胞和细菌细胞分离,这种比色杯细菌细胞过不去,之后用细菌细胞释放液裂解细菌细胞,检测释放出的ATP量则为细菌的ATP量,得出细菌总数。此检测系统与标准培养法比对,相关系数在90%以上,且测定只需5min,已被美军采用。美国CharmScience Inc有一系列通过检测细菌的ATP量来控制不同食品卫生安全的产品,如检验食物表面的PoctetSwab Plus、检测水产品表面的WaterGieneTM、检测生肉的Charm CHEF等,操作方法都是使用专用药签刮抹待测部位,然后将药签装入笔形管内,插入便携检测仪读数即可[19]。利用国标法结果可靠,但费时;利用ELISA检测时时间较短、特异性强,但样品中菌体需达到一定的数量;利用免疫荧光标记技术检测,具有特异性强、敏感性高,易于操作等特点;PCR技术检测,具有特异性强、敏感性高等特点,但在基层使用起来难度较大;阻抗法具有检测速度快、灵敏度高、准确性好等优点,但所需时间较长;颜色测定法其操作简单,但所需时间较长;增菌血清学方法,操作简单,但特异性较差;微量热量测定法在建立参考温谱图时有一定得困难;生物发光法具有快速的特点,但需有专用的检测仪。5结束语随着国民经济的发展,人民生活水平的提高,对食品质量的要求日益严格。沙门氏菌作为食品卫生检验一项重要目的菌有着重要的意义,提高沙门氏菌检出率,缩短检测时间、简化检测程序,使沙门氏菌的检测方法向自动化、快速化方向;向灵敏度高、特异性强、重复性大、简易、经济的方向不断发展。食品中沙门氏菌检测方法的研究进展@王福厚$甘肃畜牧工程职业技术学院!甘肃武威733006 @霍贵成$东北农业大学乳品科学教育部重点实验室!哈尔滨150030 @王德国$东北农业大学乳品科学教育部重点实验室!哈尔滨150030 @李永刚$东北农业大学乳品科学教育部重点实验室!哈尔滨150030本文通过查阅大量文献,对近年来食品中沙门氏菌的检测方法的进行了综述,详细的介绍了目前常用沙门氏菌的检测方法。认为,传统方法可以对沙门氏菌做出鉴定,但需要4～7d的时间;以抗体为基础的ELISA方法和免疫荧光标记方法将检测时间缩短了一半,且灵敏性高和特异性强;以核酸为基础的PCR技术由于灵敏、简单、快速和特异已被广泛用于沙门氏菌检测。但是这些方法仍然存在一定的不足,需要进一步加以改进,关于食品中沙门氏菌的检测方法的研究还有待进一步深入。
