重要转基因作物对农田生态系统的影响实验材料与方法
1)土壤理化性质及微生物数量测定
土壤微生物（细菌、真菌和放线菌）数量测定采用稀释平板法；土壤酶活性指标测定参照关松荫(1986)《土壤酶及其研究方法》的方法进行。土壤脲酶活性的测定采用苯酚钠比色法；土壤磷酸酶活性的测定采用磷酸苯二钠比色法；土壤过氧化氢酶活性的测定采用高锰酸钾滴定法；土壤速效磷、硝态氮、铵态氮含量的测定参照鲍士旦(2000)的方法。微生物量碳氮采用氯仿熏蒸-0. 5mol·L-l K2SO4浸提法(Vance et a1．，1987)，用总有机碳／总氮分析仪(德国耶拿MULTI N/C 3100)测定土壤微生物量碳(SMBC)、土壤微生物量氮(SMBN)。
2)根箱设计
三室根箱装置采用非透明有机玻璃加工而成，长13cm，宽8cm，高12cm，植物生长室宽3cm，两个土壤室宽度均为5cm。植物生长室和两个土壤室之间用30μm孔径的尼龙网相隔，将根系限制在中室内生长，便于将植物根系与土壤分开。这一设计在充分避免根系生长进入相邻土壤室，实现各室间物理分离的同时，又确保了土壤养分及根系分泌物等的室间迁移。试验装置示意图见图1.1。将新鲜土壤自然风干，过1mm筛，装入各根室用作盆栽土壤，每盒装土1.2kg。
图1.1 三室根箱剖面图
3) PCR扩增
细菌多样性采用细菌16S rDNA V3可变区通用引物34lfGC和534r进行扩增， 引 物 序 列 分别 为 341f-GC (5'-CGCCCGCCGCGCGCG-GCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3 7)釉534r(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')( Liu et al.,2009b).357f-GC( 5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCG(:CCGTCCCGCC(;CCCCCGCCCG-CCTACGGGAGGCAGCAG-3') 和518r(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3') (Muyzer et a1．,1993)。PCR的反应体系中0. 5μmol·L-1每种引物，2.5U的Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa)，5μL的10×buffer(含MgC12)，dNTP200μmol, 50ng的模板DNAo Touchdown PCR反应条件(van Hannen et a1．，1999)为95℃7min; 94℃30s，61℃ 30s(每个循环退火温度降0.5℃)，72℃30s，共10个循环；94℃ 30s，56℃30s，72℃ 30s，共25个循环；最后是72℃ 7min。
固氮细菌nifH基因采用表1.1中的引物进行巢式PCR法扩增。第1轮PCR反应体系：10pmol每种引物，0.5U的Taq DNA聚合酶，2.5μL的10×buff-er(含25mmol·L-l MgCl2)，200μmol·L-l dNTP（每种10mmol·L-l），50ng的模板DNA，补灭菌水至25μL。第2轮PCR反应体系：20pmol每种引物，1U的Taq DNA聚合酶，5μL的10×buffer（含25mmol·L-l MgCl2），200μmol·L-l dNTP(每种10mmol·L-l)，第1轮PCR产物1μL作为模板，补灭菌水至50μL。反应条件：95℃5min; 94℃1min，55℃1min(第2轮PCR采用48℃)，72℃ 1min，30个循环；72℃7mln。
表1.1用于固氮细菌和氨氧化细菌PCR扩增的引物及其序列
氨氧化细菌amoA基因采用表1.1中的引物进行PCR扩增。反应体系：20pmol每种引物，IU的Taq DNA polymerase，5μL的10×buffer(含25mmol·L-l MgCl2)，200μmol·L-l dNTP（每种10mmol·L-l），100ng的模板DNA，补灭菌水至50μL。进行DGGE的PCR反应条件：95℃ 5min; 94℃1min，65℃→55℃1min（每循环降低0.5℃），72℃ 1min，20个循环；94℃1min，55℃1min，72℃ 1min，15个循环；最后是72℃7min。
4)变性梯度凝胶电泳
采用Dcode-rM通用突变检测系统(BioRad，USA)按照操作说明进行变性梯度凝胶电泳( DGGE)分析。电泳结束后，小心取出凝胶，放在SYBRrv Green I(l：10000) (lnvitrogen，USA)染液中染色30min，然后用Gel Dox XR凝胶成像系统( BioRad，USA)观察与拍照。
5) DGGE条带回收和测序
选取DGGE图谱中差异条带进行割胶回收，用目的基因引物扩增。PCR产物用Wizard SV Gel and PCR Clean-up System试剂盒(Progema，USA)纯化后与载体pMDrM 19-T Vector(Takara)连接，转化到E．coli JM109中，用菌落PCR方法检测阳性克隆(李正国等，2009)，并将阳性克隆子进行测序。
利用NCBI-BLAST，将测序结果与GenBank数据库进行序列比对分析，获取相近典型菌株的基因序列。然后利用Clustal X l.83和Mega 4.1中的邻接法(neighbor-joining)建立系统发育树。
