原核表达
基因克隆技术
| 实验方法原理 |
一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株。如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等。 |
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| 实验材料 | 大肠杆菌 |
| 试剂、试剂盒 | 酵母膏 蛋白胨 琼脂 蒸馏水 IPTG Tris-CI DTT SDS 溴酚蓝 甘油 EDTA NaCI 苯甲基磺酰氟 溶菌酶 脱氧胆酸 DNase I TE Triton X-100 PMSF 尿素 KH2PO4 还原型谷胱甘肽 氧化型谷胱甘肽 KOH HCI |
| 仪器、耗材 | 滤膜 离心管 离心机 电泳槽 |
| 实验步骤 |
一、材料 1. 诱导表达材料 （1）LB （Luria-Bertani）)培养基 酵母膏 (Yeast extract)：5 g NaCl：10 g 蒸馏水 (Distilled water) ：1 000 ml
（2）IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 ml 蒸馏水中，0 .22 um 滤膜过滤除菌，分装成1 ml /份，－20 ℃ 保存。 （3）1x 凝胶电泳加样缓冲液： 50 mmol / L Tris -CI (pH 6 .8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS （电泳级） 0.1 % 溴酚蓝 10 % 甘油 2. 大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料 （1 ）酶溶法 50 mmol / L Tris-CI (pH 8 .0 ) 1 mmol / L EDTA 100 mmol / LNaCI ②50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。 ③10 mg / ml 溶菌酶。 ④脱氧胆酸。 ⑤1 mg / ml DNase I。 （2 ）超声破碎法 ①TE 缓冲液。 ②2xSDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：
100 mmol / L Tris-HCI (pH 8 .0 ) 100 mmol / L DTT 4 %SDS 0.2 % 溴酚蓝 20 % 甘油 二、实验方案 1. 外源基因的诱导表达 （1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。 （2 ）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。 （3 ）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定，确定无误后进行下一步。 （4 ）如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，则在30 -32 ℃ 培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6 ，迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5 h ；如果表达载体的原核启动子为tac 等，则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5 h 。 (5 ）取上述培养液1 ml，1 000 g 离心，1 min，沉淀，加100 uL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS -PAGE 检测。 2. 大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化 （1 ）细菌的裂解 常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。 a. 酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。 ① 4 ℃ ，5 000 rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 ml ）。弃上清，约每克湿菌加3 ml 裂解缓冲液，悬浮沉淀。 ② 每克菌加8 uL PMSF 及80uL 溶菌酶，搅拌20 min ；边搅拌边每克菌加4 mg 脱氧胆酸（在冷室中进行）。 ③ 37 ℃ ，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20 uL DNase I。室温放置至溶液不再粘稠。 b. 超声破碎法。声频为15-20 kHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA 进行剪切，大大降低液体的粘稠度。 ① 收集1 L 诱导表达的工程菌，40 ℃ ，5 000 rpm 离心，15 min ；弃上清，约每克湿菌加3 mlTE 缓冲液。 ② 按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌；10 000 g 离心，15 min ，分别收集上清液和沉淀。 ③ 分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2x 凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS -PAGE 。 注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关，应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3 -4 次冻溶后更容易破碎。 3. 包涵体的分离 蛋白质在细菌中的高水平表达，常形成相差显微镜下可见到的细胞质颗粒，即为包涵体，经离心沉淀后可用Triton-X100 / EDTA 或尿素洗涤，若为获取可溶性的活性蛋白，须将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。 （1）试剂与配制 ① 洗涤液I： 0.5 % Triton X -100 10 mmol / L EDTA (pH 8 .0 ) 溶于细胞裂解液中。 ② 2x凝胶电泳加样缓冲液。
（2）细胞裂解混合物12 000 g 离心，15 min ，4 ℃ ；弃上清，沉淀用9x 洗涤液l 悬浮；室温放置5 min；12 000 g
离心15 min ，4 ℃ ；吸出上清，用100 uL 水重新悬浮沉淀；分别取10 uL上清和重新悬浮的沉淀，加10 uL 2x
凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS-PAGE 。 4. 包涵体的溶解和复性 （1）试剂与配制 ① 缓冲液I： 1 mmol / L PMSF 8mol /L 尿素 10 mmol / L DTT 溶于前述裂解缓冲液中。 ② 缓冲液Ⅱ： 50 mmol / L KH2PO4 1 mmol / L EDTA (pH 8 .0 ) 50 mmol / L NaCI 2 mmol / L 还原型谷胱甘肽 1 mmol / L 氧化型谷胱甘肽 ③ KOH 和HCI 。 ④ 2x凝胶电泳加样缓冲液。 （2）用100 uL 缓冲液I 溶解包涵体；室温放置lh ；加9x缓冲液Ⅱ，室温放置30 min ，用KOH 调pH 到10.7 ；用HCI 调至pH 8 .0 ，在室温放置至少30 min ；1 000 g 离心，15 min ，室温；吸出上清液并保留，用100 uL 2x凝胶电泳加样缓冲液溶解沉淀；取10 uL 上清，加10 uL 2x 凝胶电泳加样缓冲液，与20 uL 重新溶解的沉淀进行SDS-PAGE 。
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| 注意事项 |
1. 不同的大肠杆菌表达载体带有不同的启动子和诱导成分。实验者必须根据特定系统和用途决定相应的实验方案。 2. 表达和检测时，应设置对照组，如转化载体和非诱导细胞。 3. 由于大肠杆菌中表达的重组蛋白质缺少哺乳动物细胞特异的翻译后加工，所以，其生物活性无法与天然蛋白质相提并论。
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| 其他 |
表达菌株是我们往往最容易忽视的一点。目前绝大多数重要的目的基因都是在大肠杆菌中表达的。不同的表达载体对应有不同的表达菌株，一些特别设计的菌株更有助于解决一些表达难题。
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