培养细胞膜片钳记录实验
基本方案
| 实验方法原理 |
培养细胞膜片钳记录是在无菌条件下将组织块经过机械分离和消化酶的处理后分离成单个细胞并在孵箱中培养数天后进行常规膜片钳记录的一种方法。细胞原代培养过程与急性分离细胞的过程基本一致，但前者需在无菌条件下进行 |
|---|---|
| 实验材料 | 细胞 |
| 试剂、试剂盒 | 细胞培养液一般用F-12medium 细胞分离过程用液一般用Puck's溶液 消化酶胰蛋白酶或木瓜蛋白酶(10ng ml) 胶原酶(1mg ml) 膜片钳 |
| 仪器、耗材 | 膜片钳放大器 微操纵器 防振台 显微镜 离心机 细胞培养箱等。其他辅材包括35mm细胞培养皿 离心管 游丝镊等 |
| 实验步骤 |
1.将塑料盖玻片剪成边长为5-8mm的小玻片，均匀铺在35mm的塑料培养皿中。 2.用75%酒精处理铺好玻片的培养皿30min,然后再用灭菌过的双蒸水洗1-2次，晾干后备用。 3培养细胞前Id分别用PDL(poly-D-lysine)和Laminin处理有小玻片的培养皿各1次，中间用双蒸水洗l次。 4.将所有取材所用器械在75%酒精中消毒至少30min,准备冰盒，取出消化酶放至室温，预冷Puck's溶液，将F-12media孵育在37'C水浴锅中备用。 5.将动物处死，然后在冰台上取材。所取组织迅速冲洗干净以减少红细胞的污染，然后置于冷的Puck's溶液中。 6.用事先消毒的精细剪刀去除不需要的部分，将组织块剪碎，转移至15ml离心管中。 7.加入lOng/ml木瓜蛋白酶或胰蛋白酶在37℃下消化10-15min。 8.低速离心1min,弃上清。 9加入胶原酶(1mg/ml)和dispase]](2.5mg/ml),37℃下消化10-15min。 1O.低速离心1min,弃上清。 11加入5ml预热的F-12medium,混匀后再离心1min,弃上清。 12加入含有NGF(30ng/ml)的F-l2media,用事先烧好的玻璃吸管轻轻吹打3-5次，使细胞均匀分离，必要时可用不同口径的吸管分2次吹打。 13.将分离的细胞转移至35mm事先铺有小玻片的培养皿中，然后放进孵箱中培养以备膜片钳记录。一般培养时间不超过1周均可用于膜片钳实验，但需隔天置换培养液，以保证细胞能获得很好的营养和状态。 14将有细胞贴壁的小玻片小心放进膜片钳记录的小槽内，接通灌流液即可进行常规膜片钳实验。由于培养细胞的不同，以及消化酶类型和用最的不同，培养细胞的状态也不相同，用于膜片钳记录的细胞状态要求较高一些。培养较好的细胞密度适中，细胞碎片和杂质较少（图3-3)。在进行膜片钳实验时，我们一般要注意选择健康的细胞，健康细胞的形态比较规则，表面干净光滑，贴壁较好，在显微镜下有立体感。
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| 注意事项 |
l特别需要强调的是所有的细胞操作都必须在超净工作台上进行，而且所有的手术器械，液体均需经过消毒或灭菌处理，严格保证细胞不被污染。 2根据实验要求确定培养细胞动物的年龄、性别、体重，但通常动物的年龄越小，细胞耐受力越强，活性越好。另外，为保证神经元的活性，取材时间应尽可能短。 3.根据动物的年龄调整消化酶的种类和整。胎鼠的神经组织中纤维较少，仅用胰蛋白酶消化即可；随着幼鼠的成长，神经组织中神经纤维逐渐增多，需要辅以胶原酶消化。另外还有DNA酶、木瓜蛋白酶等可以帮助消化。胶原酶及DNA酶、木瓜蛋白酶消化能力较弱，而胰蛋白酶消化能力较强，所以胰蛋白酶的量可以少些。具体实验应参考相关文献，根据神经组织的不同，调整消化酶的类型和用量。 4机械分离细胞的过程中，对组织块的吹打一定要轻，因为此时已经有部分细胞被消化分离，因此，为了避免这部分细胞不受损伤，最好选用不同口径的吸管分次吹打，以保证能收集到更多健康可用的细胞。 5膜片钳实验过程中，尤其是对千初学者，常会遇到的主要问题是封接困难，即不能形成巨阻封接，这时可检查浴液的清洁程度，如有浑浊、灰尘、杂质等，就需更换液体或保持浴液的流动。玻璃微电极应在拉制后2-3h内使用，并防尘，电极内液必须经过滤后充灌。检查电极夹持器、电极、负压吸引管组成的系统的密闭性，如果负压吸引管无漏气，说明密闭性良好，很可能是电极夹持器中的橡皮垫不完整，应更换，注意橡皮垫的孔径与电极外径要匹配。如细胞表面不光滑，也可造成封接困难，需提高单细胞标本制备中酶消化的程度。其次遇到的问题是破膜时，细胞容易与电极分开，这表明细胞膜的韧性和弹性差，细胞状态可能不好，需改进标本制作方法，保证细胞的活性。也可将电极抛光后使用。再一个问题是电极入液后，封接测试的电流基线不稳定，抖动剧烈，应检查并调节浴液的灌流系统，排除液面的震动。检查夹持器的稳定性，保证电极夹住后不活动。检查浴槽地线的银丝部分及夹持器中的银丝色泽是否发白，及时氯化，保证浴槽地线导电良好。
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| 其他 |
1对培养细胞来说，细胞的状态至关重要，所以对于消化过程中酶的选择及用量以及消化时间的控制非常重要。如消化不够，则细胞表面粗糙或有附着物覆盖，巨阻封接困难。若消化过度，则细胞表面干净光滑，封接容易，但细胞膜的弹性差，封接后破膜及记录过程中细胞容易和电极分离，细胞存活时间也短。因此，一定要针对不同的标本调整消化条件，在多次实验后确立合适的消化酶量及消化时间。其次，可在消化过程中，每隔5min轻轻摇晃离心管，使得组织块和酶能充分混匀，达到比较好的消化效果。最后，在记录的前1d最好给细胞换液，以确保细胞记录前有足够的营养，以保持最好的状态。
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