采用Agilent Femto Pulse系统对不同基因组DNA提取进...（二）
Femto Pulse 系统使用基因组
DNA 165 kb扩展法来分离大于 80 kb 的提取 gDNA（图 1）。使用 Agilent ProSize 数据分析软件上的
Smear Analysis 选项卡分析 gDNA 的分子量分布。弥散条带分子量分布包含整个弥散条带范围内的浓度分布。酵母 gDNA
的弥散条带分子量分布和完整性随使用的提取方法不同而变化。使用提取方法 A、B、C、D、E 得到的基因组 DNA 样品的弥散条带分子量依次减小（表
1）。液相提取法 A 和 B 得到了分子量最大的完整 gDNA 弥散条带。用传统液体苯酚-氯仿提取法 (A) 提取的基因组 DNA 产生的完整
gDNA 较长，平均为163670 bp，而另一种液相提取方法 B 为103111 bp。方法 C 离心柱 gDNA 提取方法和方法 D 膜 gDNA 提取方法，在五种不同提取方法中表现出相似的弥散条带分子量分布结果。
在使用基因组 DNA 165 kb 扩展法分析时，方法 E 离心柱 gDNA 提取方法得到的电泳图显示整个 gDNA 样品均分子量小于 80
kb。因此，将使用快速法和扩展法分析的方法 E 样品进行对比（图 2）。两种方法对样品 E 得到的弥散条带分子量相近，为 30579 和
27388 bp（分别对应于快速法和扩展法）。在此示例中， 1 小时的快速法运行时间更短，故优于扩展法。
Femto Pulse 系统与脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 的对比
过去，16 至 18 小时的 PFGE 分析是测定 50 kb 以上 gDNA 质量和分子量的唯一选择。随着技术的进步，Femto Pulse
系统成为唯一一款能够在短短 70 分钟内评估 165 kb 以内 gDNA 分子量和质量的仪器。用 Femto Pulse 系统取代过夜运行的
PFGE，省去了数天专门用于质量控制检查的时间，从而节省了时间和金钱。ProSize
数据分析软件自动提供峰分子量、电泳图和数字化胶图，实现样品质量和分子量的快速测定。相比之下，PFGE
运行需要采用额外软件进行用户评估，以获得计算分子量值。此外，Femto Pulse 系统将样品起始量降至皮克级，节省了宝贵的样品材料。
对于测试的所有提取方法，Femto Pulse 系统扩展法与 PFGE 凝胶得到的 ProSize 数字化胶图中的 gDNA
浓缩条带区域具有相近的分子量（图 3）。Femto Pulse 系统的高灵敏度使其能够检出因浓度低而无法在 PFGE 上检出的完整 gDNA
弥散条带范围。此外，Femto Pulse 系统的出色分辨率有助于区分用方法 B、C、D 提取的分子量相近的gDNA 样品。
基因组质量值 (GQN)
提取 DNA 的质量会因为提取方法、样品处理和组织类型的不同产生很大差异。因此，在使用样品前通过质量控制分析来确定高度完整的 gDNA 十分重要。基因组质量值 (GQN) 专为 ProSize 设计，可以轻松实现定制化的 gDNA 质量评估。用户可针对其特定应用设定合适的分子量阈值。然后，ProSize 根据高于指定分子量阈值的总测量浓度分数计算 GQN 值。GQN 以 0 到 10 的等级对样品进行评分，0 表示样品均未超过阈值，10 表示 100% 的样品高于阈值。
在需要分析不同分子量的 gDNA 时，能设置可自定义的 GQN 分子量阈值是一项巨大的优势。用户可以根据具体样品确定合适的分子量阈值，以便客观判断哪些样品可满足用户要求。将方法 A、B、C、D、E 提取的酵母 gDNA 的 GQN 分子量阈值设为 50 kb。随着 gDNA 样品分子量的减小，GQN 分别为 8.2、7.4、6.1、3.0、1.1（分别对应于方法 A、B、C、D、E， 表 1），与预期相同。GQN 还表示高于分子量阈值的样品百分比。例如，GQN 8.2 表示高于 50 kb 阈值的样品占 82%。也就是说，有 18% 的样品低于阈值。方法C 和 D 得到的分子量相近（分别为 77 和 62 kb），但得到的 GQN 分别为 6.1 和3.0，差异很大。GQN 所反映出的差异主要是由于弥散条带分布不同，因此相近平均分子量的 gDNA 的质量水平不同。在确定最佳 gDNA 提取方法和适用于下游应用的样品时，需要同时考虑样品的分子量和质量。
结论
Agilent Femto Pulse 系统是唯一能够替代
HMW gDNA 过夜 PFGE 分析的自动化系统，可以在 70 分钟内完成分析，大大节省时间和金钱。此外，Femto Pulse
系统将样品起始量降至皮克级，节省了宝贵的样品材料。Agilent ProSize 数据分析软件能够报告用户定义的 GQN
质量评分，该评分客观代表了每个样品中 HMW gDNA 的百分比。在确定最佳 gDNA
提取方法和适用于下游应用的样品时，同时需要考虑样品分子量和质量。使用 Femto Pulse 系统和安捷伦基因组 DNA 165 kb
试剂盒对比了通过不同方法提取的 DNA 样品的分子量和质量。与其他液相、离心柱和膜提取方法相比，传统酚-氯仿提取方法得到的 gDNA
最长且最完整。Femto Pulse 系统具有极高的分辨率，可以区分平均分子量相近的 gDNA 样品间的不同分子量分布，这是传统PFGE
无法实现的功能。
参考文献
1. Pocernich, C.; Uthe J.; Wong K-S. Quality Assessment of Genomic
DNA for Biobanking Samples（用于生物样本库样品的基因组 DNA 质量评估），安捷伦科技公司应用简报， 出版号
5994-0520ZHCN，2018
2. Fan, H.; Gulley, M. L. DNA Extraction from Fresh or Frozen Tissues.In Methods in Molecular Medicine: Molecular Pathology Protocols, Killeen, A. A., Ed.; Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2001; vol. 49, pp 5–10
3. Pocernich, C.; Uthe, J.; Wong, K-S. Genomic DNA Sizing andQuality
Control on the Agilent FemtoPulse System（在 Agilent FemtoPulse 系统上进行基因组
DNA 分子量测定与质量控制），安捷伦科技公司应用简报，出版号 5994-0516EN，2017
