摘 要：目的: 探讨柴胡注射液对学习记忆行为影响的机制。方法: 每天2 次给予小鼠腹腔注射不同剂量的柴胡注射液, 连续5 天后采用行为观察和生化检测相结合的方法, 研究柴胡注射液对小鼠学习记忆行为的影响, 包括剂量- 效应关系和时间- 效应关系以及脑内超氧化物歧化酶( SOD) 、丙二醛( MDA) 和NO 含量的变化。结果: 与注射生理盐水的对照组相比, 在5 种剂量( 50 、100 、200 、400 和800 mg / kg) 中除了50 mg / kg 外, 其他4 种剂量的柴胡注射液均能显著提高小鼠Y- 迷宫分辨学习的能力及24 h 记忆保持率, 其中400 mg / kg 剂量的效果最好; 最佳剂量的柴胡注射液易化记忆的作用在训练后24 ~ 72 h 均显著增强( P < 0.01 ) , 以24 h 最为显著; 最佳剂量的柴胡注射液可显著提高行为训练后小鼠脑内SOD 的活性( P < 0.01 ) 、降低脂质过氧化产物MDA 水平( P < 0.01 ) 以及提高NO 含量( P < 0.01 ) 。结论: 适当剂量的柴胡注射液在一定时间内具有提高小鼠学习记忆能力的功效, 该作用可能与伴随的脑组织抗氧化能力提高和NO 含量改变有关。

关键词：柴胡; 学习记忆; 超氧化物歧化酶; 丙二醛; 一氧化氮

学习和记忆是神经科学研究中的一个重要领域, 越来越多证据表明机体内过量自由基的产生与学习记忆密切相关.近年来研究发现, 柴胡对缺血再灌注引起的肝肾损伤具有保护作用, 其机制可能与抑制氧自由基形成有关, 但关于其对学习记忆的影响尚未有报道。因此, 本研究通过对柴胡小鼠学习记忆行为和脑内生化指标的观测, 初步探讨柴胡改善学习记忆的作用及机制。

1 材料和方法

1.1    材料

昆明种小鼠, 雄雌各半, 体重18 ~ 22 g, 由东南大学公共卫生学院动物实验中心提供, 适应性饲养2 天后正式进入实验。柴胡注射液( 每1 ml 含柴胡生药1 g) 为陕西西安亚宝制药厂生产, 批号20030404 ; 脑内超氧化物歧化酶( SOD) 测定试剂盒( 批号20031003 ) 、丙二醛( MDA) 测定试剂盒( 批号20031003) 、NO 测定试剂盒( 批号20031003) 及考马斯亮兰蛋白测定盒( 批号20031003 ) 均由南京建成生物工程公司提供。其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药方法

将140 只小鼠随机分成空白对照组、生理盐水对照组、50 mg / kg 柴胡组、100 mg / kg 柴胡组、200 mg / kg 柴胡组、400 mg / kg 柴胡组和800 mg / kg柴胡组。各组小鼠按各自所配浓度0.2 ml / 10g 腹腔注射, 每天2 次, 间隔8 h , 连续给药5 天, 生理盐水对照组腹腔注射等体积生理盐水。1.2.2 Y- 迷宫分辨学习的检测方法小鼠分辨学习能力的检测按文献[ 5 ] 方法进行。1 天内连续分段训练小鼠, 每10 次为一段, 两段间小鼠休息1 min , 一直训练到10 次反应中有9 次正确反应( 即90% 的正确反应率) 作为学会的标准。记录小鼠达到学会标准所需训练的次数, 次数越少, 说明学习能力越强。将给予柴胡处理的小鼠达到学会标准所需训练的次数与正常小鼠达到学会标准所需训练的次数相比, 计算学习改善率, 反映小鼠学习能力改变的情况。间隔24 h 检测小鼠在10 次训练中的正确次数, 代表小鼠的24 h 记忆成绩。将小鼠的24 h 记忆成绩与学会的标准相比, 计算24 h 记忆保持率。同法检测小鼠的48 和72 h 记忆保持率。保持率越高, 说明动物的记忆力越好。1.2.3 小鼠脑组织SOD 活性、MDA 含量及NO 含量的测定SOD 活性测定 小鼠行为检测后, 立即断头处死, 冰上取大脑, 用生理盐水制备10% 脑组织匀浆液, 4℃离心取上清液, 用721 型分光光度计在波长550 nm 处测定其光密度值, 并按公式算出SOD 的活性。MDA 含量的测定 小鼠行为检测后, 立即断头处死, 冰上取大脑, 用生理盐水制备2 % 脑组织匀浆液, 4 ℃离心取上清液, 用721 型分光光度计在532 nm 波长处测定其光密度值, 再按公式求出MDA 生成量。NO 含量的测定 实验结束后小鼠立即断头处死, 冰上分离大脑, 去除嗅球和小脑, 用冰生理盐水冲洗血迹, 再用滤纸擦干, 电子分析天平称重, 按脑组织: 生理盐水为0.5 g ∶1 ml 比匀浆, 以3 000 r / min,4℃离心15 min , 取上清液, 冻存待测。由专业技师严格按照操作说明进行操作。

1.2    统计学方法

用Grubb 法对实验数据的可疑值进行取舍, 数据以均数±标准差( x ±s ) 表示, 组间比较采用t 检验。P < 0.05 为差异有显著性。

2 结 果

2.1 柴胡注射液对小鼠学习记忆影响的剂量- 效应关系Y- 迷宫行为检测结果显示, 不同剂量的柴胡注射液对小鼠分辨学习能力和记忆保持的影响并不一致。如表1 所示, 与生理盐水对照组相比, 除50 mg / kg 剂量的柴胡注射液组对小鼠的分辨学习能力的影响无统计学意义外, 其他4 种剂量的柴胡注射液均显著增强小鼠的分辨学习能力( P < 0.01 ) ,呈明显的剂量- 效应关系; 对记忆保持百分率而言,除50 mg / kg 剂量以外, 其他4 种剂的柴胡注射液都有明显易化记忆的作用。与生理盐水对照组相比,100 ~ 800 mg / kg 的剂量都显著提高24 h 的记忆持率, 其中400 mg / kg 的效果最好, 其记忆保持率提高34.45% 。

2.2 柴胡注射液对小鼠记忆影响的时间- 效应关系由上述量- 效关系说明400 mg / kg 的柴胡注射液对小鼠24 h 记忆保持的易化作用最佳。本实验进一步用该剂量观察了柴胡注射液对小鼠Y- 迷宫分辨学习的48 及72 h 记忆保持的影响。结果表明400mg / kg 的柴胡注射液易化记忆的作用在训练后24 ~72 h 均显著增强( P < 0.01 ) , 以24 h 最为显著, 虽然48 ~ 72 h 有所下降, 但仍明显地优于该时相的生理。

2.3 柴胡注射液对小鼠脑组织SOD 活性和MDA生成的影响为探讨柴胡注射液提高小鼠分辨学习能力, 增强记忆的脑内机制, 空白对照组、生理盐水对照组和最佳剂量( 400 mg / kg) 柴胡注射液组的小鼠行为检测后进行脑组织SOD 活性和MDA 含量的测定。该剂量的柴胡注射液能明显提高脑组织SOD 活性, 减少MDA 的生成( P < 0.01 ) 。

2.4 柴胡注射液对小鼠脑组织NO 含量的影响实验发现, 柴胡注射液400 mg / kg 能明显提高正常小鼠脑内NO 的含量( P < 0.01 ) 。

3 讨 论

学习记忆是大脑最高级的功能, 是衡量动物发育的重要指标。国内外多采用建立条件反射的方法检测动物的行为和高级脑功能, 其中Y- 迷宫法广泛应用最为广泛。本实验结果显示: 柴胡注射液在一定剂量范围内能明显提高小鼠在Y- 迷宫中的分辨学习能力和记忆的影响力; 其易化记忆的效应在训练后24 h 最佳, 虽然48 ~ 72 h 有所下降, 但仍明显地优于该时相的生理盐水对照组, 其中最佳剂量组小鼠伴随有脑组织中SOD 活性的提高和MDA 水平的下降。SOD 是机体抗脂质过氧化酶促防御系统中的一个重要酶, 它能特异性清除生物氧化产生的超氧阴离子自由基。自由基可引发脂质过氧化的链式反应, 过氧化脂质的分解终产物MDA 通过交联、结合形成脂褐素, 损伤细胞膜, 引起神经系统的功能障碍, 在行为上表现为脑功能的衰退。因此, 本研究认为柴胡改善小鼠学习记忆功能可能与其伴有SOD 活性的提高, 从而增强SOD 终止自由基链锁反应的作用, 间接减少MDA 的产生有关, 但具体机制还需深入探讨。本实验观察到柴胡注射液最佳剂量组的小鼠脑组织中NO 含量与生理盐水组相比明显提高( P <0.01 ) , 提示柴胡改善学习记忆能力的作用可能与其提高脑组织中NO 的含量关系密切。目前普遍认为海马突触效应的长时程增强( LTP ) 可能是学习记忆的突触机制, NO 作为逆向信使参与LTP 的形成和维持过程。动物学习记忆过程中, 不同脑区的NO 水平增高, 本实验结果与此相符。诚然, 也有研究发现伴有空间学习障碍的小鼠海马部位的NO含量增多, NO 介导神经毒性作用, 从而损伤学习记忆功能。笔者推测这可能与NO 具有神经毒性和神经营养的“双刃剑样”作用有关, 当NO 含量在合理范围内波动时, 可能介导神经营养作用, 当NO 的含量过低或过高时, 则表现为神经毒性作用。综上所述, 适当剂量的柴胡注射液在一定时间内具有提高小鼠学习记忆能力的功效, 该作用可能与其伴有脑组织抗氧化能力提高和NO 含量改变有关, 其机制值得进一步探讨。