体内荧光成像技术的进展（三）
成像新策略的出现
改进探针亲和性的多种途径
探针同靶点的紧密和特异性结合通常是成像成功的关键。因为许多成像靶点都位于细胞表面之外，所以多途径原则可以用来改善探针的结合亲和性。最近有两篇文献报道了用于异种移植肿瘤αvβ3
整合素（integrin）体内成像的RGD（Arg-Gly-Asp
）寡肽的设计。Cheng等合成了单体、二体和四体环RGD，并将它们耦合于Cy5.5，用于活小白鼠的肿瘤成像实验。Cy5.5-RGD
四体表现出最高的肿瘤吸收活性和最高的肿瘤-本底荧光比。Ye等对完整小白鼠中的线形多体RGD–cypate（一种近红外碳花青素分子探针）耦合物的内在化和定位进行了监控，发现αvβ3
整合素受体结合亲和性和肿瘤吸收依赖于多价RGD成分的数目和空间排布。
寻找新探针的噬菌体文库筛选法
对系统的分子库筛选策略的研究已有很长时间，这类研究的目的是鉴定靶点特异性抑制剂和先导药物，最近已把此类研究延伸到分子成像领域。Newton等用体内噬菌体显示和micropanning分析（微筛法，噬菌体捕获分析）在小白鼠中选择能够溢出和结合人PC-3前列腺癌异种移植物的噬菌体，以用于体内成像的近红外染料AlexFluor
680对鉴定出的噬菌体克隆进行标记，结果显示，此克隆表现出高肿瘤-肌肉荧光比。组合化学法也用于筛选具有高亲和性的拟肽配体(LLP2A)探针。Peng等提出用于活细胞筛选的一珠一化合物的组合文库法，成功地鉴定出一种新的拟肽配体(LLP2A)，该配体以高亲和性和特异性结合于αvβ3
整合素，可用于αvβ3 整合素体内肿瘤NIR成像。
可激活活性探针
活性探针能产生反差，这一结果是通过将探针保持在靶点部位、并且迅速从血液循环和非定靶部位清除造成的。对于高分子量的探针来说，这一清除过程非常缓慢。一个只有结合到靶点才能激发出荧光的探针，有望克服这一困难。最近Swager等设计出一种NIR染料，叫NIAD-4，它能跨越血脑屏障，特异地检测转基因小白鼠脑中的类淀粉-β沉积物。与以前述及的AIO987不同，NIAD-4当结合于凝集的类淀粉纤维时，它在610
nm
的荧光发射增加了400倍。Weissleder等报道指出，一种远红外吲哚花青素类荧光团，当结合于白蛋白时，荧光发射显著提高，因此适宜于用荧光分子断层扫描特异显示体内肿瘤组织。应用靶点激活的小分子荧光色素，是一种非常有用的细胞内靶点成像途径，因为造影机制并不依赖于探针是否快速从循环和非靶点部位清除。
探针的酶促摄入
Tsien等设计了一个酶促“认门”策略，借此选择性地将成像探针准确无误地输送到靶细胞。可激活探针由两个片段组成，一是为某一NIR染料所标记的能穿透细胞的多阳离子肽(CPP)；一是能够阻遏被CPP诱发的细胞摄入的多阴离子封堵肽。这两部分通过对基质金属蛋白酶-2（一种在肿瘤中高度表达的酶）敏感的多肽接头而连接在一起。此探针一经到达肿瘤部位，接头便被蛋白水解酶降解掉，释放出被标记的CPP部分，继而发生细胞移位。报道探针在靶点细胞中的积累，原则上可以导致信号放大和灵敏性提高。这种成像策略在体内已被证明是成功的，它能显示小白鼠纤维肉瘤细胞和植入的人鳞状上皮细胞瘤组织。我们最近证明，这一策略同样可用诸如QDs一类纳米颗粒来做。
基于连接的探针
以蛋白质活性为基础的蛋白质组学图式是应用荧光标记蛋白质底物或抑制剂而作出的，底物或抑制剂能同靶点酶形成共价加合物。
Blum
等最近把这一策略应用到体内蛋白酶成像研究。他们的设计以半胱氨酸蛋白酶可以被酰氧甲酮共价抑制为依据，所用的探针是连接于淬灭剂酰氧基离去基团的荧光色素标记肽。在蛋白酶存在下，此探针就会发荧光，并且以共价键结合于酶上。虽然这一设计已经证明在活细胞中有效，但在体内实验中的效用仍待测试。
新报道基因技术
红和近红外荧光蛋白质
所谓报道技术就是应用报道基因作为必要工具研究基因表达和调节的技术。体内成像应用的报道基因有几种，其中编码荧光蛋白(FPs)的基因仍然最为常见，因为这些蛋白质有其遗传编码，易于应用，无需系统传送成像探针。在癌症研究中，以荧光蛋白为基础的体内成像，可以用来直接显示原始肿瘤的生长、侵染、转移扩散、肿瘤血管生成以及肿瘤与周围环境的相互作用。最先发现的FP是水母中的绿色荧光蛋白，其后利用遗传工程创造出许多突变体，所以荧光发射范围很广。Tsien等经过多次体细胞超突变结合荧光活化细胞计数，产生出具有红和近红外荧光(648
nm)发射的荧光蛋白质变体，这些新的荧光蛋白质变体极大地克服了荧光颜色选择的限制，更适合于体内荧光成像研究。
β-半乳糖苷酶
β-半乳糖苷酶(β-gal)是另一种常用的报道蛋白，它能产生多种可被检测的荧光和颜色。例如，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷(X-gal)通常用于β-gal基因表达的成色鉴定；而荧光素双-β-d-半乳糖苷酶(FDG)则可用于活细胞成像。此外，据最近报导，其改良低物TG-βGal可用于单相动力学活细胞成像，而且优于FDG。为了把β-gal的离体和活细胞成像方面的应用扩展到体内成像领域，Tung等发现，一种先前用到的底物吡喃半乳糖糖苷衍生物(DDAOG)可以用来显示活小白鼠中β-gal的表达。DDAOG被β-gal切割后，可以释放出荧光团DDAO，后者最大的发光波长在659
nm处，比DDAOG向红光方向移动了50
nm。然而，DDAO的发射光谱同其激发光谱离得很窄，这就明显地限制了这一报道蛋白的灵敏性。另一个重要发展是β-gal体内成像中报道蛋白-酶循序技术，它极大地提高了β-gal报道蛋白的灵敏度。Blau等利用具有体内高度灵敏性的生物发光报道蛋白萤火虫荧光素酶(FLuc)，并将它同叫做d-虫荧光素-d-半乳糖苷辅剂(Lugal)的商品底物结合在一起，用于β-gal的体内成像。β-gal先对Lugal进行切割，释放出d-虫荧光素，d-虫荧光素再经FLuc氧化而产生光。最近这些改进使得β-Gal成为集离体、细胞培养和体内成像大成的单一报道蛋白。
β-内酰胺酶
TEM-1β-内酰胺酶(Bla)是一小分子量(29
kDa)的细菌单体酶，它是另一常用的报道蛋白，已广泛地用于生物学过程以及哺乳动物组织培养活细胞相互作用的检测和成像。例如，用Bla研究启动子和调节子的活性等，因为它可以显示RNA拼接、监测病毒感染、检测蛋白质之间的相互作用以及展示细胞表面蛋白水解酶的水解活性等，有关的荧光原底物多有报道。最近，我们设计了用于活细胞中Bla成像的细胞穿透性NIR
荧光原底物，我们用了一对荧光共振能量转移(FRET)体Cy5-QSY21。底物头孢菌素在7-氨基处连接于
NIR荧光团Cy5，同时在3′端连接于淬灭剂QSY21。此探针还连接了一个d-氨基葡萄糖类似物，以帮助细胞摄入活动。培养物中表达Bla的C6细胞可以用此探针进行成像。此外，科学家还对此探针进行了修饰，成功地对活小白鼠中C6神经胶质瘤进行成像。
生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用介导的受体成像
与上述的三种光学报道蛋白系统相反，一种基于生物素-链霉抗生物素蛋白紧密相互作用的受体成像新技术，已被Tannous等用于培养物和体内报道蛋白标记细胞的成像。这种报道蛋白是一种重组膜蛋白(BAP-TM)，它含有一生物素受体肽(BAP)。BAP可以被内源的生物素连接酶加上生物素而被“生物素化”，随后将被标记的链霉抗生物素蛋白注入，以便选择性地结合生物素化的报道蛋白。这种通用的技术可以用于其他形式的体内成像，例如核磁共振成像等。
新趋势
高分辨率体内成像
体内荧光成像技术与荧光显微镜不同之处在于，它所检测的是细胞群的大宗信号，但分辨率较低。与此相反，荧光显微内镜应用小光学探针（一般直径为0.25–1
mm），将它们以最小损伤的方法插入固体组织中，达到组织深层高分辨成像的目的。这种技术与荧光探针相结合，可以在单细胞和单分子水平上检测活组织的生物活动。
多峰形性成像
体内荧光成像与核磁共振、X光计算机断层扫描(CT)一类剖视性成像互相配合，可以提供互补信息，克服荧光成像的缺陷，诸如光子对组织穿透性受限制以及三维空间分辨率低下等。多功能探针的研发日益受到关注，已经浮现出一些新技术研究，包括基于离子氧化物和树枝体的双MRI–荧光成像造影剂、
X光计算机断层扫描(CT)-荧光成像融合技术系统等。
荧光寿命成像
目前大多数体内成像研究都局限于测量荧光强度的变化。但是，荧光寿命成像(FLIM)与光强度测量不同，它对探针局部浓度的依赖性小，从固有特性看，只要有光吸收和散射，它就能“大显身手”，虽然它对环境的变化十分敏感。近来，有些学者通过发展三维荧光寿命扫描成像以及用NIR肽探针对肿瘤异种移植进行成像的途径，开始研究在活的小动物中利用整体FLIM的问题。
结论
体内荧光成像技术可以展示整体活的小动物中荧光团的荧光发射状况。利用日臻完善的荧光探针和报道蛋白，这种技术正在成为探索基础研究和临床应用之间联系的重要纽带。传统的小分子NIR染料虽然继续被使用，但是用于体内荧光成像的有机、生物和无机的荧光纳米颗粒却提供了更有力的工具，在许多应用方面令人惊叹不已。这些纳米颗粒可以用作构建适合于多态成像的多功能探针。成像策略和报道蛋白技术的创新，定会极大地改进探针的特异性和灵敏度。基于高分辨率和荧光寿命的体内荧光成像的进展，可能会进一步增强成像技术的性能。这些新技术持续不断的进步，一定会有更多的分子靶点和疾病被成功探测出来。
