不同的胞外蛋白酶活性造成肿瘤特异的血清多肽组表达模式

Josep Villanueva, David R. Shaffer, John Philip, Carlos A. Chaparro, Hediye Erdjument-Bromage,Adam B. Olshen, Martin Fleisher, Hans Lilja, Edi Brogi, Jeff Boyd, Marta Sanchez-Carbayo,Eric C. Holland, Carlos Cordon-Cardo, Howard I. Scher, and Paul Tempst

Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, New York, USA

摘要：

　　新近研究表明，通过质谱法已建立了多种独特的血清多肽组表达模式库，而血清多肽组表达模式与临床症状密切相关。阐明血清中多肽组成的序列特征及其产生机制，将有助于将血清多肽组表达模式作为可靠的疾病标识而更加广为接受。我们采用一种高度优化的多肽提取方法和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术进行的研究表明，仅靠一套有限的血清多肽表达模式（一个特征），即可将3种类型的实体肿瘤患者和未患癌的对照受试者准确地区分开来。61个特征肽段的靶序列识别结果显示，这些肽又可分为密切相关的几个簇，大多数是由于造成肿瘤类型特异性差异的胞外蛋白酶活性影响了体内结合蛋白质的水解过程和补体的降解过程而产生的。这一特征肽段家族成员虽少、但功能极为强大，可精确预测前列腺癌样本的分级，其准确度与其他标准方法可比。

　　总之，本研究表面，疾病的肽段标记物表达谱和蛋白酶活性的差异之间存在直接的相互关联，而且，本文中所描述的几种肽段表达模式在临床上有望用作癌症检出和分级的标记物，同时我们的发现对未来的肽段生物标记物的研究也具有重要的提示意义。

前言

　　近年来的科学进展，包括基因组测序^[1]和模拟复杂的生物体系的新技术^[2]有望帮助我们提高抗癌治疗的水平。然而，目前的最佳抗癌治疗策略仍然有赖于早期发现及密切检测早期复发，以便能够合理地调整治疗方案^[3]。尽管如此，令人乐观的是，基因组和蛋白质组研究的进展将为我们提供新的或改进原有的分子诊断手段，帮助我们预测患者对个体化治疗的反应性，并据此将其进一步分成不同亚组^[4,5]。良好的生物标记物筛选方法，应当是创伤小而重复性好，最为理想的是通过简单的血样或尿样检测即可检测出肿瘤组织特异性分子。此外，筛选技术应足够灵敏，既可检测出早期癌症，又可准确地将未患癌症者进行区分^[3]。

　　虽然基因中携带有遗传信息，包括癌症或其他疾病的遗传易感性，但在正常健康或疾病状态时，真正赋予生物体的表现型的却是基因的产物。由于存在众多的蛋白质结构、功能和降解的翻译后调节机制，仅靠对于基因的认识甚至已难以圆满解释生物体系的复杂性。从筛选的角度来讲，由组织分泌或释放入血流中也主要是蛋白^[6,7]。然而尽管经过了数十年的倾心研究，已鉴定的癌症生物标记物中，证明确实具有临床意义的也不过寥寥数种蛋白、且全是血浆蛋白（如前列腺特异性抗原[PSA]、癌胚抗原[CEA]、癌抗原125 [CA125]和甲状腺球蛋白），常常需要结合其他诊断工具才能预测患者对治疗的反应性、复发和生存率、对病情进行分级和监测治疗效果，而无法用于大范围人群筛查^[8,9]。而那些在血浆或血清中的浓度为纳摩尔级别的蛋白质，需要专门的放免试验才能检出并定量^[10,11]。因此，发现新的、更好的癌生物标记，开发出简单易行的检测方法势在必行。尽管目前已经有底物特异性的蛋白酶（如胰蛋白酶），可将复杂的蛋白质混合物降解为肽段进行质谱分析，但由于仪器的动力学量程以及在统计学处理之前，检测低丰度肽段所需的、与多次质谱检测相配合的复杂的分级分离过程的限制^[12]，这类想法均尚未付诸实现。

　　癌症过程中，细胞类型的转化和转化后表达高水平的蛋白质和酶（如PSA和PSMA）的细胞的增殖^[13,14]，不但使已有血清蛋白（血清蛋白组）的变化^[6,7]，而且也影响到其代谢产物（血清多肽组）。研究表明，人血清中含有数千种蛋白水解而产生的肽段^[15,17]，但这一复杂的多肽组是否与整体生物的生物学事件之间存在密切关联，到目前为止尚属未知。当前质谱技术的发展，已可以检测几个毫升的血清样本中成百上千的小到中等大小的肽段^[17,18]，最近几篇报告已开始利用质谱相关技术对血清肽进行定性和定量检测（常称为特征码或条形码），作为是否患有某种疾病（如癌症）的指征^[119-24] 。不过，此类工作争议很大，因为越来越多的证据表明，临床过程和分析化学及信号处理过程中未经控制的变异可能会使研究结果可信度大打折扣^[12,25-29] 。在分析过程中所应用的低级的质谱设备缺乏精确性，分辨率不够高，再加上到目前为止仅阐明了少量的有争议的标记物的特征 ^[130-32]，使怀疑论更加膨胀。如果几个不同的实验室分别证明了这些看似差异明显的多肽具有相似的氨基酸序列，则可表明这一新技术确实具有潜在价值。然而到目前为止，此工作尚在进行中。

　　图1. 对MS技术获得的3组癌症患者和健康对照组的血清多肽表达谱的无监督分级聚类分析和主成份分析。 (A) 按照标准操作规程制备的健康志愿者和晚期前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌患者的血清样本。在自动固相多肽提取和MALDI-TOF MS分析前随机分为4组。质谱图经处理后采用Qcealign script进行匹配，每个样品获得一个包含651 个m/z值（换算后的离子强度）的峰列表。图中数字代表各组中患者和对照组的例数。(B) 采用标准关联作为各癌症组与正常组间二元距离标尺的平均-连锁分级聚类无监督分析。所有的峰值均被采用。柱表示样品，横排为m/z峰。树状图颜色编码方案同A。热图中，标准化后的离子强度值为从0（绿色）到200（红色），中点为100（黄色）。(C) 3个癌症组和正常组的分级聚类分析（与B相应）。(D) 3个癌症组和正常组的主成分分析(PCA)。颜色编码同A。造成原始数据变异的3个主要成份见图。

　　为完成这一目标，我们曾开发了一种利用反相磁珠俘获被分析物，借助于(MALDI-TOF)技术的自动操作程序以同时检测血清中存在的各种肽段(18, 29)。此系统的灵敏性优于芯片表面俘获^[33] ，因为球状颗粒的结合表面积较小直径斑点更大，因此结合能力也更强。与高分辨率MS 或MS/MS联用时，可同时检测一滴血清中的数百种肽段，并且多数可不经再次分级而直接测定。这一自动化特性使得操作方便，并保证了实验结果的重现性。为使此系统更趋完美，我们还开发了一种基于最小熵的运算法则，简化并改进了质谱图的校准和后续的统计学分析工作^[29] 。有了这些工具在手，我们再次探讨了是否某种选定的已知序列的血清多肽的表达模式可能有助于 (a) 将癌症与非癌症区分开，(b) 区别不同类型的实体瘤，(c) 利用一个独立的效验设置预测癌症的分级。