对流免疫电泳
实验概要
本实验介绍了对流免疫电泳(counter immune electrophoresis)的原理及操作流程。
实验原理
对流免疫电泳又叫反向免疫电泳或免疫电渗电泳。其原理为：在pH值8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的负电荷，而且它分子又较大，所以泳动慢，受电渗作用的影响也大，往往不能抵抗电渗作用，故在电泳时，反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分子又较小，所以泳动快，虽然由于电渗作用泳动速度减慢，但仍能向正极泳动。如将抗原置阴极，抗体置阳极，电泳时，两种成分相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇，并在比例适当的地方形成肉眼可见的沉淀线。这样由于电泳的作用，不仅帮助抗体定向移动，因而加速了反应的出现，而且也限制了琼脂扩散时，抗原抗体向四周自由扩散的倾向，因而也提高了敏感性，本法比琼脂扩散法的灵敏度要高10～16倍。
实验步骤
1. 制备琼脂板：
1) 首先配制pH值8.6，μ=0.075的巴比妥缓冲液(配法：巴比妥钠15.45g，巴比妥27.6g，蒸馏水加至1 000ml)。然后取优质琼脂粉1～12g加到巴比妥缓冲液100ml中，配成巴比妥琼脂；
2) 琼脂板的大小可根据需要选择，一般多用宽7(或5)cm，长12(或75)cm玻璃板，将其洗净后，烘干。制板时，将上述琼脂溶化，凉至56℃左右，用吸管吸取溶化琼脂加在玻璃板上，使琼脂厚3mm左右，待琼脂凝固后打孔，孔的直径3mm，两行相距5mm，同一玻板放置两排或三排抗原抗体对，每排间距26mm。
2. 加样品：用滴管分别吸取抗原和抗体，直接加入琼脂板的相应孔内。
3. 电泳：把加好样品的琼脂板放在电泳槽内，板的两端用滤纸搭桥，与缓冲液相连，槽内装的巴比妥缓冲液浓度可比琼脂板中的高一倍或相同。电泳时，抗原端接负极(-)，抗体端接正极( )。
电泳时，通常以板的宽度计算电流，以板的长度计算电压。可用5～6V/cm的电压，2～4mA/cm电流，实际工作中，可根据具体条件灵活掌握，一般泳动时间为30～60min后，即可观察结果，若沉淀线出现的不清晰，则可置于37℃温箱或室温(25℃)下再放数小时，效果会更好些。
4. 结果
通常于通电30～60min后，即可于两孔之间出现沉淀线。如抗原量少，沉淀线不清晰，可把琼脂板放在湿盒中，置37℃保温数小时，沉淀线的清晰度有时可得以加强。
注意事项
1. 对流免疫电泳是根据抗体球蛋白在pH值8.6的琼脂凝胶中只带少量负电荷，在电泳过程中不能抵抗电渗作用，因而向阴极倒退；而一般抗原多数不是免疫球蛋白，它们带负电荷多，电泳过程中抵抗电渗作用后，仍向阳极移动，因此，二者在两孔间相遇处生成沉淀线的原理设计而成的一种免疫电泳。如果抗原抗体都是免疫球蛋白，或者它们的电泳迁移率非常接近，电泳时都向一个方向泳动，就不能作对流免疫电泳检查。
2. 进行对流免疫电泳时，对所用琼脂质量应严格掌握。试验结果表明，电渗过大的西德进口琼脂不适于作对流电泳用，而日本进口琼脂及处理后的国产琼脂，其性能均较好。琼脂浓度要适当，浓度太高，可影响抗原抗体扩散速度；浓度低时，虽然抗原抗体扩散快些，但不易打孔和取出琼脂块，故以1%～12%的浓度较合适。
3. 抗原抗体比例适当，容易出现沉淀线，反之不易发生。
4. 电压与电流低时，电泳时间需要长；电压和电流加大时，电泳时间可缩短。但电压过高则能使孔径变形，甚至琼脂溶化。
