ELISA的试剂-2
3.1.3 包被用抗原
用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三
大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能作包被用。如
HBsAg可以从携带者的血清中提取，一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取，蛋白
成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等（例如AFP从脐带血或胎肝中提取）。重组抗原
是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的
优点是除工程菌成份外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。以大肠杆菌
为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份，用于ELISA，在反应中可出现假阳性，
因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能
用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不
能培养成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCV ELISA中所用包被
抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中，不少重组抗原
如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得应用。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分
子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决
定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原
的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质（BSA）等偶联，借助于偶联物与固
相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与
其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇，因此在受
检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外，某些微生物发生变异时往往发
生抗原结构变化，在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。
3.1.4 包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的
腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗
体，必须除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接
用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐
析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提
高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中
单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适
当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对
一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
3.1.5 包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH等应根据试验的特点和材
料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用
pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入
包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被
的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的
浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。
3.1.6 封闭
封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体
包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相
关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手
续与包被相类似。最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血
清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可
以高浓度使用（5%）。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶
粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。
封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA固相均需
封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活
性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时，
因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。
但在间接法测定中，封闭一般是不可少的（见2.2.2）。包被好的ELISA板干燥后放入密
封袋或锡袋中，在低温可保存数月。
3.2 结合物
结合物即酶标记的抗体（或抗原），是ELISA中最关键的试剂。良好的结合物应该是
既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。结合物中酶与抗体（或抗
原）之间有恰当的分子比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶
或游离的抗体（或抗原）。此外，结合物尚要有良好的稳定性。
3.2.1 酶
用于ELISA的酶应符合以下要求：纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳
定，来源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最好
在受检标本中不存在相同的酶。另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产
物易于测定等。
在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷
酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化
酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
国产ELISA试剂一般都用HRP制备结合物。HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分
子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一
种卟啉蛋白质。主酶无色糖蛋白在275nm波长处有最高吸收峰，辅基是深棕色的含铁卟啉
环，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP的纯度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意为纯度
数）表示，是403nm的吸光度与280nm吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥?.0。
HRP除符合上述的ELISA中标记酶的要求外，更有价格低廉和性质较稳定的特点。值
得注意的是，在选用酶制剂时，除其纯度RZ外，更应注意酶的活力。高纯度的酶如保存不
当，活力也会降低。酶制剂的活力以所含的酶活力单位表示，可用对底物作用后生成产物
量的测定进行试验。
国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶。常用的AP有两个来源，分别
从大肠杆菌和小牛肠膜中提取。不同来源的酶生化特性特性略不相同，从大肠杆菌中提取
的AP分子量为80000，酶作用的最适合pH为8.0；用小牛肠膜中提取的AP分子量为
100000，最适pH为9.6。在ELISA中，AP系统的敏感度一般高于HRP系统，空白值也较
低，但AP价格昂贵，制备结合物所得率也较HRP低。
3.2.2 抗原和抗体
制备结合物时所用抗体一般 均为纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干
扰。最好用亲和层析纯的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀
释度进行反应，实验结果本底浅淡。如用F(ab')2进行标记，则更可避免标本中RF的干扰。
在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。
3.2.3 结合物的制备
酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
（1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过
它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊
二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。
ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效（结合率达60%-70%）
和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结
合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在两步法中，
先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先
将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比
例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较
一步法低。
（2）过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用
此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基
形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结，其最佳比例为：酶/抗体=1-2/1。此
法简便有效，一般认为是HRP最可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批
实验结果不易重演。
按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有
的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并
不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减
少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体
后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐
析法最为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的游离酶，但相当数量的
游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取，高
效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分：游离酶、游离抗体和纯结合物而取
得最佳的分离效果，但费用较贵。
结合物制得后，在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合
物，既不经济，又可使本底增高；结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须
对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个
低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标
抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反
应的最高稀释度。例如某一HRP：抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000，表示该制剂经
1:5000稀释后，在与人IgG包被的固相作ELISA试验时，将发生阳性反应。但在用于具体
的ELISA检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度
以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进
行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。
3.2.4 结合物的保存
酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较
为稳定，冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且
使用时需经复溶，颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的
冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以
稀释液（见3.2.5）临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已
用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。由于蛋白
质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和
防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠），以防止细菌生长。
3.2.5 结合物的稀释液
用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体
上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如1%牛血清白蛋白），通过竞争以
抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，
如吐温20，0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也
可应用这种稀释液。
3.3 酶的底物
3.3.1 HRP的底物
HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶
作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-
phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS
[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度
高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水，OPD·2HCL为水溶
性。曾有报道OPD有致异变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底
物应用液后更不稳定，须现配置现用。在试剂盒中，OPD和H2O2一般分成二组分，OPD
可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢则配
入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中
则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应
用液。
TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试
剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等
优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈
黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。
ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。
另一种HRP的底物为3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，
经HRP作用后，产物显荧光，可用荧光光度计测量。用于ELISA的优点为可加宽定
量测定的线性范围。
HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物
(urea peroxide)。H2O2应用最多，但尿素过氧化物为固体，作为试剂较H2O2方便、稳
定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏水溶解后，在底物缓冲液中密闭、低温（2
～8℃）可稳定1年。
3.3.2 AP的底物
AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作为底
物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用
NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。
AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用
显色底物的比色法。
3.4 洗涤液
在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。
3.5 酶反应终止液
常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式
ELISA中一般采用2mol/L。
3.6 阳性对照品和阴性对照品
阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控
制品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与
检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血
清在各种ELISA模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血甭较难得到，国外试剂
盒中的对照品多以复钙人血浆(recalcified human plasma)为原料，即在血浆中加入钙离
子，使其中的纤维蛋白质凝固，除去凝块后所得的液体，其组成与血清相似。阴性对照品
须先行检测，确定其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最
好抗HBs也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待
检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称，在测定中得到
的吸光值与受检标本吸光值比较，可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测
HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml，阳性对照品中含量约为10ng/ml。在对照
品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。
3.7 参考标准品
定量测定的ELISA试剂盒（例如甲胎蛋白质癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用
的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂
的缓冲液中。
