流式细胞仪在生物学中的应用
流式细胞仪在生物学中的应用 耿慧霞 ,王 来 ,王 强 (河南大学生命科学学院 ,河南开封 475001) 摘 要 :简要论述了流式细胞仪(flow cytometry ,FCM) 的工作原理 ,并对其在生物学基础科学研究中的应用进行阐述 ,包括 对细胞凋亡、细胞周期、免疫细胞、细胞受体的研究应用。 关键词 :流式细胞仪 ;细胞凋亡 ;细胞周期 中图分类号 :Q331. Q2 文献标识码 :B 文章编号 :1008 - 9632(2005) 04 - 0044 - 02 流式细胞仪(flow cytometry , FCM) 研制、发展、革新 和应用领域的扩展 ,都是由生物学、生物技术、计算机 科学、电子工程学、流体力学、激光技术、分子生物学、 有机化学和物理学等多个学科综合发展和应用而实现 的。近代流式细胞仪 ,由于单克隆抗体技术、定量细胞 化学和定量荧光细胞化学的应用 ,使其在生物学、临床 医学等众多研究领域的应用愈来愈广泛和重要 ,尤其 在生物学中对细胞周期的动力学分析、细胞因子、细胞 凋亡、信号传导、RNA/ DNA 的分析、细胞表面受体及特 异性抗原的分析等领域发挥着独特作用 ,具有操作简 单、分析精确、重复性好、费用低廉、分析速度快等优 点。 1 流式细胞仪的基本知识 1. 1 流式细胞仪的基本参数 1. 1. 1 前向角散射(forward scatter , FSC) 前向角散射 和细胞的直径密切相关 ,可用来检测细胞的大小 ,通常 在应用中 ,可将其设为阈值来排除样品中的各种碎片 及鞘液中的小颗粒物质对被测细胞的干扰。 1. 1. 2 侧向角散射 (side scatter , SSC) 又称 90 散射 光 ,侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏 感 ,因此可用来反映细胞表面形态、细胞内颗粒大小及 分布形态 ,还可用于反映细胞内的精细结构等等。 1. 1. 3 其它参数 用荧光标记物标记某些待检的目 标成分 ,将标记过的细胞上机检测 ,在光源激发光的激 发下 ,可检测到待检测成分在细胞中的位置和含量 ,荧 光强度的强弱可反映出待测物质的多寡 ,如异硫氰酸 荧光素(FITC) 标记后发出的绿色荧光、PE 标记后发出 的红色荧光和其它荧光染料标记后的其它颜色的荧 光。 1. 2 流式细胞仪的工作原理 经荧光染料标记过的细胞样品制成单细胞悬液 , 以一定的流速经过喷嘴 ,流速的选择与检测的目的有 关 ,此液流刚好经过光源发出的激光形成的聚焦区 ,此 时 ,标记的荧光染料在激发光的激发下发射出特异颜 色的荧光信号和散射光信号 ,信号的强弱与细胞内待 测组分的含量呈正比。荧光信号和散射光信号经过光 电倍增管和光电探测器接收后转换成电脉冲 ,送入计 算机处理 ,应用不同的分析软件可分析样品的各种参 数 ,最后以直方图或三维图的形式显示出来。此外 ,还 可以用不同的标记物进行双参数、三参数、甚至多参数 的分析。另外 ,运用流式细胞仪根据细胞的形态或标 记染料的荧光信号对细胞进行分选 ,以便进一步培养 研究。 2 流式细胞仪在生物学中的应用 流式细胞仪在医学临床方面应用的较为广泛 ,如 肿瘤分析、白血病分析、血液病的分析、机体感染状态 分析等等 ,近几年来 ,由于学科交叉的发展和科学研究 的深入 ,流式细胞仪在生物学中的应用也越来越广泛 , 如在细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学、神经生物 学、微生物学 ,分子免役学 ,植物学等等许多生物学基 础学科的应用和在细胞凋亡、细胞周期调控、细胞因子 及细胞分型等研究中的应用。 2. 1 对凋亡细胞的分析 细胞凋亡是生物体生长发育过程中出现的正常现 象 ,在生物体形态构成、正常细胞更替以及维持细胞内 环境稳定等过程中发挥重要作用 ,主要是由基因控制 44 第 22 卷第 4 期 2005 年 8 月 生 物 学 杂 志 JOURNAL OF BIOLOGY Vol. 22 No. 4 Aug ,2005 的细胞自主性的有序的死亡过程。流式细胞仪检测凋 亡细胞的方法包括以下三个方面 2. 1. 1 形态学的检测 凋亡细胞一般都出现细胞膜皱缩、核解聚、凋亡小 体形成、胞浆浓缩、体积减小等形态学上的特征 ,经过 流式细胞仪的前向角散射 (forward scatter , FSC) 和侧向 散角射 (side scatter ,SSC) 分析后 ,即可区分出凋亡细胞 和正常细胞 ,凋亡细胞的典型特征是前向角散射下降 和侧向角散射升高。 2. 1. 2 DNA 含量分析 在凋亡细胞内 ,由于细胞核的解聚和凋亡小体的 形成 ,核内的总 DNA 含量下降 ,应用荧光染料对 DNA 进行标记 ,可检测凋亡细胞。常用的荧光标记染料有 两类 :一是可与单体 DNA 片段结合 , 这类荧光染料有 hoechot33342 ,4′,6 - 二眯基 - 2 - 苯吲哚 (DAPI) 及光辉 霉素等 ;一种是可与降解的 DNA 片段结合 ,这类荧光染 料碘化乙啶(EB) 、丫啶橙(AO) 等。由于在凋亡细胞内 DNA 含量下降 ,在 G1 峰前出现亚二倍体峰 ,称亚 G1 期 峰 ,又称凋亡小峰。 2. 1. 3 DNA 断裂点标记法 细胞凋亡的最后阶段是形成 DNA 片段 ,DNA 断裂 点法检测的即是 DNA 的断裂片段 ,即标记 DNA 断裂的 3′- 羟基末端 ,常采用由 DNA 聚合酶 I 催化的原位缺 口转移 (in situ nick translation , ISNT) 或用 TdT 介导的 dUTP 原位缺口末端标记 (terminal deoxynucleotidyl trans2 ferase mediated dUTP nick end labeling ,TUNEL) 技术 ,ISNT 和 TUNEL 法均可进行间接或直接标记。间接标记物常 为生物素化脱氧三磷酸尿苷(biotin - dUTP) 或地高辛配 体(Dig) - dUTP 等 ,此外还需要连 霉亲和素或抗 Dig - dUTP ,使标记反应增倍 ,提高灵敏度 ;直接 标记的标记 物常为异硫氰酸荧光素(FITC) - dUTP。 2. 2 对细胞周期的分析 流式细胞仪对 DNA、RNA 含量及细胞周期的分析 具有独特的特点 : (1) 测定细胞内 DNA 变异系数小 ,一 般为 1 %～2 % ; (2) 可正确分辨二倍体、四倍体、近二倍 体及非整倍体 ,准确进行细胞周期分析 ; (3) 分析数据 多、统计结论可靠 ; (4) 分析结果直接以图形形式显示 , 形象直观。 流式细胞仪对细胞周期的分析主要是对单个细胞 内 DNA 含量的分析 ,通过标记物发出红色荧光的强弱 可推算出 G0、G1 期(二倍体) 、S 期(超二倍体) 、G2 ,M 期 (四倍体) 的比例 ,其敏感性和特异性均超过其它方法 , 其结果以 DNA 分布的直方图的形式显示 ,进而可计算 出 G0/ G1 ,S/ G2 + M 比率来了解细胞的增殖能力 ,并可 了解细胞的增殖状态。此外 ,细胞周期的分析可以准 确的反应细胞的异常增殖即癌化的潜在状态 ,一般来 说 ,高 S 相比率 (S - phase fracrion ,SPF) 和高增殖指数 的细胞都可以理解为潜在癌细胞或癌细胞。所以 ,流 式细胞仪在医学临床上的应用主要集中在癌细胞的早 期诊断、鉴别治疗、判断预后及疗效评价等领域。 2. 3 对免疫细胞的分析 1993 年在波士顿召开的人类白细胞分化抗原 (1eukocyte differentiaion antigen ,HLDA) 会议将 CD(cluster of differentiation) 抗原分为 T 细胞、B 细胞、髓细胞、血小 板、内皮细胞、自然杀伤细胞、黏附因子、细胞因子和细 胞因子受体等九组 ,确立了 48 种新的抗原。1996 年 11 月在神户召开的第六届 HLDA 会议上又有 30 多种新抗 原被确认。目前 ,CD 编号已达 166 ,CD 抗原已有 197 种。CD 抗原的分析对于揭示淋巴细胞的分型和机体 的免疫状态具有决定意义 ,外周血 T 淋巴细胞亚群 (CD3 + 、CD4 + 、CD8 + ) 及其比值(CD4 + / CD8 + ) 是机体免 疫状态的主要参数。应用不同系列的 CD 单克隆抗体 , 再以不同的荧光染料标记 ,流式细胞仪能区分出不同 的淋巴细胞亚群 ,并可计算出它们的数量及相互之间 的比例 ,由此就可反映出机体的免疫状态或感染疾病 状态 ,如在自身免疫功能亢奋时 ,可引起自身免疫病 , 如类风湿性关节炎 (RA) 、系统性红斑狼疮(systemic lu2 pus erythematosus , SLE) 等 ,在自身免疫病状态下可见 CD4 + / CD8 +的比值会显著增高 ;再比如 ,HIV 感染者的 CD4 +细胞会被病毒大 量的破坏 ,所以 ,CD4 + / CD8 + 的 比值会小于 1 ,因此 ,检测 CD4 + T 细胞的绝对值和 CD4 + / CD8 +的比值可反映机体感染 HIV 的情况。 2. 4 细胞特异性标记物的分析 用可以结合细胞表面或胞内特异性抗原的单克隆 抗体处理待分析的材料后 ,再利用免役荧光的方法和 流式细胞技术相结合 ,即可辨认和区分出带有特异性 抗原的细胞 ,这样 ,就为检测某些膜上或胞内含特异性 抗原的细胞提供了一种简捷途径 ,如培养的细胞群体 , 在不同的生长阶段细胞表面会有不同的表面抗原 ,要 鉴别某一生长期的细胞就可以应用这种方法。 此外 ,应用流式细胞仪不仅可用于细胞 ,细胞因子 及其受体的定性分析 ,还可以用于定量分析 ,用标记已 知数量荧光素分子的标准微球做参照 ,可以计算出每 个细胞抗原决定簇的个数 ;另外对细胞表面受体 ,如低 密度脂蛋白受体、凝集素受体、胰岛素受体、淋巴因子 (下转 51 页) 54 第 22 卷第 4 期 2005 年 8 月 生 物 学 杂 志 JOURNAL OF BIOLOGY Vol. 22 No. 4 Aug ,2005 系或包容与被包容等关系的一系列概念 ,因此 ,后学习的 概念可用概念同化方式来获得。但向学习者呈现概念的 定义后 ,还应进一步分析说明 ,以帮助学生加深理解。先 学习的概念仍需要根据其类型来确定获得方式。 4. 3 建立新旧概念之间的联系 ,提高概念教学效率 根据奥苏伯尔认知同化理论 ,新知识的获得主要 依赖认知结构中原有的适当观念 ,即起固定作用的观 念 ,通过新旧知识的相互作用达到意义上的同化 ,同化 不仅使新知识获得了新的意义 ,而且也使原认知结构 中相关观念获得了新的意义。因此 ,在生物学概念教 学中 ,应注意建立新旧概念之间的联系 ,使学生能尽快 从认知结构中找到同化新概念的起固定作用的概念 , 以提高概念教学的效率。例如 ,学习“反射”(指人或动 物 ,在神经系统参与下 ,对外界或内部的刺激作出的有 规律的反应) 概念时 ,应使学生联系到以前知道的“反 应”概念 ,学习“条件反射”、“非条件反射”概念时 ,使学 生想到“反射”,这样把学习建立在学生已有认识基础 上就会提高学习效率。 参考文献 : [1 ]皮连生. 学与教的心理学[M]. 上海 :华东师范大学出版社 , 1997. [2 ]邵瑞珍. 教育心理学[M]. 上海 :上海教育出版社 ,1988. 70 , 74 ,78～79 ,106～109. [3 ]袁维新 ,刘孝华. 生物学教学中促进错误概念转变的策略 [J ]. 生物学教学 ,2003(10) . Teaching research of biology concept ZHOU Xu lian1 ,RUI Jian2 ,MACun mei3 (1.Life Science College in Ningxia University Yinchuan 750021 China ;2. Ningxia Constraction Vocatigual Technology Institute Yin chuan 750020 ;3. Hui Minority Middle School of Xiji of Ningxia 756200) Abstract :The article researched meaning ,obtaining means(assimilated concept ,formation of concept) type of biology concept ,and put forward basic strategy of concept teaching。 Keywords :biological concept ;assimilated concept ;concept teaching (上接 45 页) 受体、白介素受体和干扰素受体等及细胞内受体 ,如雌 激素受体、糖皮质激素受体等也可进行类似的定性和 定量分析。 3 结语 流式细胞仪发明的初期 ,主要应用在对细胞的分 选上 ,随着计算机技术 ,免疫学的发展以及单克隆抗体 技术的发明 ,随后才在生物学和医学、药学等领域的应 用越来越广泛 ,如细胞动力学分析、细胞调亡、细胞分 型、肿瘤的诊断、药物疗效分析等许多领域。近年来 , 新型多功能流式细胞仪的开发 ,多参数分析技术的建 立 ,以及各种功能强大的分析软件的开发等 ,为流式细 胞仪检测结果准确性的提高和分析能力的扩展提供了 保障 ,可以相信 ,在未来生物学和医学领域 ,流式细胞 仪的应用范围会进一步扩大 ,应用深度会进一步加强。 参考文献 : [1 ]徐 滨 ,林波海 ,吴 维等. 新型多功能流式细胞仪的研制 [J ]. 生物物理学报 ,1998 ,(14) 3 :558～564. [2 ]周 丽 ,周振英. 流式细胞仪研制的技术进展[J ]. 现代医学 仪器与应用 2003 ,(15) :11～17. [3 ]李嘉言 ,车绪春 ,张锡宝. 流式细胞仪在医学研究与检验工作 中的应用[J ]. 广东医学 2004 ,(25) 1 :96～98. [4 ]张盈华. 流式细胞仪在医学检验中的应用[J ]. 中华医学检验 杂志. 1997 ,(20) 4 :203～204.
-
产品技术
-
焦点事件
-
技术原理
