高效液相色谱法测定环境空气中的苯并芘
一、方法原理
环境空气中苯并[a]芘用超细玻璃或石英纤维滤膜收集，二氯甲烷或乙腈萃取，浓缩纯化，高效液相色谱分离，荧光检测器检测，保留时间定性，外标法定量。
二、试剂和材料
除非另有说明在分析中使用符合国家标准的分析纯试剂实验用水是新制备的超纯水或蒸馏水。
乙腈（CH3CN）：高效液相色谱纯。
正己烷(C6H14)：经高效液相色谱纯化.
二氯甲烷（CH2Cl2）：高效液相色谱纯。
无水硫酸钠(Na2SO4)：在马弗炉使用前加热4小时。4小时，冷却，密封，储存在玻璃瓶中。
二氯甲烷正己烷混合液：3+7即用。
苯并[A]PYRene标准储备液：40=100，g·mL，溶剂为乙腈，直接采购许可标准品溶液，参照标准品溶液证书保存。
苯并[a]芘标准中间体：ρ=10.0μg/ml。
将1.0 0ml苯并[a]芘标准贮存液准确地除去到10 ml瓶中，体积固定，与乙腈混合。储存期为1年。
苯并[A]Pyrene的标准品溶液为：0．00～2．00，g·ml～（-1）。
准确转移1.00毫升苯并[a]芘标准中间体至5毫升容量瓶中，用乙腈稀释，混匀。密封在4℃以下，避光冷藏6个月。
过滤膜对0.3μm标准颗粒的截留效率不小于99％，过滤膜在400℃的马弗炉内加热5小时以上，冷却后储存在过滤膜盒内，取样前和取样后过滤膜不被污染，取样前处于平坦状态。
硅胶固相萃取柱：1000mg/6ml，也可根据杂质含量选择合适容量的商用固相萃取柱。
有机相针式过滤器：13mm，0.45μm，聚四氟乙烯或尼龙滤膜。
三、仪器和设备
高效液相色谱法：具有荧光检测器和梯度洗脱功能。
色谱柱：4.6mm至250mm，采用ODS-C18（十八烷基硅烷键合硅胶）柱或其他类似色谱柱，填料为5.0。mM
采样器：满足hj93或HJ/T 374对采样器的要求大流量采样器工作点流量为1.05m\179；/min；中流量采样器工作点流量为100L/min；小流量采样器工作点流量为16.67L/min..
萃取设备：低频超声波清洗机、索氏萃取机或性能类似的加压流体萃取机。
浓缩设备：氮气分布器、K-D浓度计或其他等效设备。
净化装置：固相萃取装置。
一般实验室仪器和设备。
四、样品
样品采集
环境空气采样点的布设应符合HJ 194的要求，无组织排放监测点的布设应符合HJ/T 55的要求；采集颗粒物的采样时间、频率和粒径应符合相关标准的规定。
采样时，用无锯齿钳将滤膜放入干净的滤膜中，滤膜表面朝向进气方向，滤膜被紧密压缩将滤膜夹放入采样器中，设定采样时间等参数，启动采样器开始采样。采样结束后，用镊子取出滤膜，将滤尘向内折叠，避免滤尘表面触及无尘边，放入收纳盒中..
样品保存
样品采集后，滤膜密封避光保存迅速送回实验室20℃下2个月内完成提取；制备好的样品4℃避光保存，30天内完成分析。
试样的制备
样品提取
超声波提取
除去滤膜边缘无粉尘部分后，将滤膜分成N等份，将其中1份粉碎，放入塞瓶中，加入适量二氯甲烷超声提取15min，用无水硫酸钠干燥，转移至浓缩瓶中，反复提取三次，合并提取液，浓缩纯化一般情况下，整个直径为9cm的滤膜每次需要加入35ml的萃取溶剂。
用乙腈萃取滤膜，将碎滤膜放入10 ml瓶塞中，用5.0ml乙腈准确提取15 min。提取液经有机相针状滤池过滤后，丢弃初始液体，将滤液收集到样品瓶中进行检测。
索氏提取
将滤膜放入索氏萃取器，加入100 ml二氯甲烷，提取时间为16h，回流时间不少于5次/h。萃取后，冷却至室温，取出底瓶，清洗萃取杯接口，将清洗液转移至底瓶。提取液用无水硫酸钠干燥后转移至浓缩瓶中浓缩纯化..
自动索氏提取
将滤膜放入自动索氏提取器中加入100毫升二氯甲烷回流提取至少40个循环。萃取后，冷却至室温，取出底瓶，清洗萃取杯接口，将清洗液转移至底瓶。提取液用无水硫酸钠干燥后转移至浓缩瓶中浓缩纯化..
加压流体萃取
将过滤膜置于加压流体提取槽中，将萃取温度设定为100℃，压力为1500Psi2000Psi，静态萃取为5分钟，二氯甲烷的洗脱体积为池中体积的60％，氮气被吹扫60s，静态萃取至少两次提取物用无水硫酸钠干燥，转移到浓缩瓶中进行浓缩和纯化。
样品浓缩
在富集装置中，二氯甲烷样品萃取液浓缩到45°C以下。溶剂完全转化为正己烷，浓缩为1ml，纯化；如果不需要进一步净化，溶剂可转化为乙腈，恒定体积为1.0毫升，并转移到样品瓶进行测试。
样品净化
硅胶固相萃取柱固定在净化装置上柱床依次用4毫升二氯甲烷和10毫升正己烷清洗.柱填充正己烷后，流量控制阀关闭.经过5 min的润湿后，控制阀打开，流出液被丢弃。当液位略高于柱床时，将浓缩的样品提取液移入柱内，用1.0ml二氯甲烷正己烷混合液洗涤样品瓶两次，将洗涤液一起移入柱内，接收出水，用8.0ml二氯甲烷正己烷混合液洗脱，洗涤液流经净化塔后，关闭流量控制阀，浸泡5分钟，然后打开控制阀，连接收集洗脱液，直到洗脱液完全流出。
将洗脱液浓缩后，将溶剂转化为乙腈，转化为1.0ml，转移到样品瓶中进行检测。
五、分析步骤
高效液相色谱仪参考条件
柱温35℃；进样量10μL；荧光检测器激发波长（λEx）/发射波长（λEM）：305nm/430nm。
流动相A：乙腈；流动相B：水。
标准曲线的建立
取适量苯并[a]芘标准溶液，用乙腈稀释，制成标准系列。质量浓度分别为0.025μg/ml、0.050μg/ml、0.100μg/ml、0.500μg/ml、1.00μg/ml和2.00μg/ml。
将标准系列的溶液依次注入高效液相色谱(HPLC)中，并根据仪器的参考条件进行分离和检测。得到了不同浓度的苯并[A]Pyrene的色谱图以浓度为横坐标，相应的峰高（或峰面积）为纵坐标绘制标准曲线
试样测定
按与标准曲线相同的仪器条件测定样品，记录色谱峰的保留时间和峰高或峰面积当样品浓度超过标准曲线的线性范围时，用乙腈稀释，然后测量。
