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睾丸间质细胞(LCs)m6A修饰提供新治疗靶点在不育症治疗

2020.9.01

  m6A是真核生物中最常见的一类RNA修饰,目前已有的研究表明m6A在加速mRNA代谢和翻译,以及在细胞分化、胚胎发育和压力应答等过程中起重要作用。这一次,研究重大发现m6A修饰在“人类繁衍”中也发挥着重大意义,该方向的发现将会吸引着更多的科研工作者探究在m6A与“不孕不育”的密切联系。云序生物一直关注m6A研究动态,今天为大家带来的文章刚好揭示了m6A修饰调节睾丸间质细胞发育的过程。

  2020年1月31日,m6A调节睾酮合成一文发表在Autophagy (IF=11.059)期刊上,该文章采用多组学联合应用技术检测睾丸间质细胞(LCs)m6A甲基化修饰,这项研究揭示m6A 甲基化在LCs中调节睾酮合成中的作用,通过利用m6A 甲基化研究作为无精子症和少精子症的治疗靶点,为新的治疗策略提供了方向。

  发表期刊:Autophagy

  影响因子:11.059

  发表时间:20200131

  实验方法:MeRIP-seq, RNA-seq,CoIP, ChIP, RIP, MeRIP-qPCR等(云序生物提供此服务)

  原文链接:m6A mRNA methylation regulates testosterone synthesis through modulating autophagy in Leydig cells

  文章内容

  1.自噬对LCs中睾酮的合成至关重要

  本研究中作者检测了LCs自噬标记物LC3B-II,发现LCs中LC3B-II在细胞分化过程中表达增加,并且在成年人LCs中达到峰值。此外LC3B-II在LCs从茎细胞向成体细胞分化过程中表达量增加,同时血清睾酮水平逐渐升高。进一步研究发现沉默ATG7后抑制HsCG诱导LC3B-II表达和睾酮分泌,表明LCs自噬介导睾酮合成。

  图1. LCs自噬介导睾酮合成

  2.LCs的自噬依赖于AMPK信号通路

  为了探究LCs自噬过程参与的信号通路,根据前期研究发现磷酸化AMPK亚基PRKAA2 Thr172是自噬过程中典型的启动者,并且可以增加其下游蛋白p-ULK1 Ser555的表达,本次实验中发现在LCs从茎细胞向成体细胞分化的过程中,细胞中p-RKAA2 Thr172和p-ULK1 Ser555水平稳定升高,而且AMPK抑制剂有效抑制HsCG诱导LC3B-II增加,并减少PRKAA2 Thr172和ULK1 Ser555的磷酸化,这些结果证实了LCs自噬诱导依赖于AMPK信号通路。

  图2. LCs的自噬依赖于AMPK信号通路

  3.CAMKK2/PPM1A参与PRKAA2 Thr172磷酸化过程

  为了探究在LCs中HsCG诱导p-PRKAA2 Thr172 增强表达的机制,作者检测了两种经典的磷酸化激酶CAMKK2和STK11/LKB1以及去磷酸化酶PPM1A,数据显示HsCG可以诱导的CAMKK2表达增加和PPM1A的表达减少,此外,TM3细胞和初级LCs在CAMKK2敲低或者过表达PPM1A后,明显抑制了HsCG诱导增加LC3B-II的表达、AMPK活化和降低SQSTM1的表达。

  图3. CAMKK2/PPM1A参与PRKAA2 Thr172磷酸化过程

  4. LCs中的睾酮合成受m6A mRNA修饰调控

  根据前期研究数据显示m6A修饰可以参与胚胎发育,那么是否也能够影响LCs发育呢?作者利用比色法检测整体甲基化水平(云序生物提供此服务),发现在LCs发育过程中m6A整体水平逐渐下降,同时ALKBH5(Eraser)和FTO(Eraser)表达逐渐增加和METTL14(Writer)表达下调。为了进一步研究m6A修饰在LCs发育调控中的重要作用,作者还检测了无精子症或少精子症患者体内LCs中m6A的甲基化水平,实验表明这些患者体内的甲基化水平升高了,并且m6A和HSD3B(睾酮合成能力检测)呈负相关,提示m6A修饰可能介导LCs中睾酮的合成。

  图4. LCs中的睾酮合成受m6A mRNA修饰调控

  5.m6A甲基化影响Camkk2 RNA的稳定性

  既然m6A能够影响AMPK信号通路的激活,那么m6A修饰是否作用于Cammkk2呢?作者通过MeRIP-qPCR(云序生物提供此服务)技术证实Cammkk2存在2个甲基化修饰位点,同时经过HsCG处理后甲基化水平明显下降,并且利用RIP(云序生物提供此服务)实验分析发现Cammkk2与YTHDF2(Reader)紧密结合,这也证实了m6A修饰降低Camkk2的转录表达。

  图5. m6A甲基化影响Camkk2 RNA的稳定性

  6. m6A甲基化促进Ppm1a的翻译

  作者观察到YTHDF1(Reader)或METTL14敲除后LCs中PPM1A的表达降低,但是Ppm1a mRNA的水平没有明显变化,有可能是蛋白稳定性或者翻译效率导致Ppm1a蛋白表达下降。利用蛋白翻译抑制剂CHX处理LCs,观察METTL14敲除与未敲除后PPM1A在LCs中的降解速率,实验结果表明HsCG降低了Ppm1a的表达,而敲除ALKBH5却没有;并且RIP(云序生物提供此服务)实验分析发现PPM1A与YTHDF1紧密结合,同时CoIP(云序生物提供此服务)分析表明HsCG处理后促进了YTHDF1与EIF3A(真核翻译起始因子3)和EEF2(真核翻译起始因子2)结合,这些结果都说明m6A只是通过调节PPM1A的翻译而不是影响蛋白的稳定性。作者利用MeRIP-qPCR(云序生物提供此服务)进一步探讨Ppm1a甲基化位点信息,发现Ppm1a存在5个甲基化修饰位点,并且位于3’U 区域甲基化位点能够促进Ppm1a的翻译。

  图6. m6A甲基化促进Ppm1a的翻译

  7. HsCG对METTL14/ALKBH5的影响

  研究发现HsCG通过诱导METTL14降解降低其表达,并且通过提高ALKBH5转录水平增加ALKBH5的表达,而CHIP实验(云序生物提供此服务)也证实HsCG诱导促进TFEB和CEBPB与ALKBH5启动子的结合从而提高其转录水平,增加ALKBH5的表达。

  图7. HsCG对METTL14/ALKBH5的影响

  总结:

   细胞的生长与分化依赖于基因的调控表达方式,越来越多的研究表明m6A 甲基化在更多领域发挥着关键作用,而本文作者正是利用多组学MeRIP, RIP, CoIP, CHIP(云序生物提供此服务)等多种技术联合分析,揭示了m6A修饰通过影响Camkk2转录的稳定性和Ppm1a的翻译效率调节LCs自噬从而影响睾酮的合成,该研究不仅利用m6A RNA甲基化作为治疗血清睾酮水平降低无精子症或者低精子症患者的靶点提供了新的治疗策略,还为m6A RNA甲基化功能机制研究提供了新的方向,有望作为治疗“不孕不育”的新思路。m6A甲基化始终作为近来科研热点,相信此次m6A新领域新方向的发现将会聚焦更多的目光,云序生物一直以来致力于RNA修饰测序服务,能够快捷高效助你开拓RNA修饰新“市场”,此时不出手更待何时。更多咨讯请电话热线直拨,云序RNA甲基化修饰专家给您全方位解答。

  图8. m6A通过睾丸间质细胞的自噬调节睾酮的合成

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