核酸凝胶电泳-3

3、电泳：电压＜10V/cm，电泳至溴酚兰移出样品槽到凝胶板的2/3距离时，关闭电源。
4、取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察，即可见桔红的DNA区带。
【注意事项】
1、加样时枪头不要碰坏孔壁，否则DNA带型不整齐。大多情况下，加样时不必更换枪头，可在阴极槽中反复吸打电泳缓冲液清洗，但对Southern印迹转移和需回收DNA时，应每个样品使用新的枪头，以避免样品交叉污染。
2、上样缓冲液不仅提高样品的密度，使样品均匀沉到样孔底，还使样品带色，便于上样，估计电泳时间和判断电泳位置。

3、EB是一种强烈诱变剂并有中度毒性，应戴手套操作，对于含有EB的溶液也不应直接倒下水道，用后妥善净化处理：EB含量大于0.5μg/ml溶液先用水将EB浓度稀释至0.5μg/ml以下，每100ml溶液加入100mg活性碳，不时轻轻摇荡混匀，室温放置1小时，滤纸过滤将活性碳与滤纸密封在塑料袋中作为有害废物丢弃。或用专用一次性染料清除袋（Gene有限公司）吸附过夜，再焚烧袋子即可。
4、应在暗箱窗口观察结果，避免紫外线操作者的损伤。
5、电泳过程中，EB向阴极移动（与DNA相反），延长电泳时间，EB会从凝胶中迁移出来，从而使小片段DNA难于检测，可将凝胶浸在0.5μg/ml EB溶液中重新染色后检测。
6、加样孔的加样量依DNA样品中片段的数量及大小而定，通常对0.5cm宽的加样孔，DNA上样量在0.1~0.5μg即可有良好的观察效果。如样品为酶切产物（由大小不同的DNA片段组成），每孔加20~30μg DNA也不致明显影响分辨率。

7、小的凝胶——微型凝胶和中型凝胶的电泳一般比大的凝胶要快，常常用于快速分析。当选择微型或中型凝胶装置时要考虑凝胶槽盛装缓冲液的体积，小胶通常要在高压下电泳（>10V/cm），所以选择一个相对较大的缓冲液槽比较有利。
四、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel PAG）是通过丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙酰胺（Bis）在一个适当的自由基催化的作用下共聚合而成的高分子多孔化合物。常用聚合方法有化学聚合和光聚合两种。化学聚合的催化剂通常采用过硫酸铵（AP），此外，还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，常用的加速剂为四甲基乙二胺（TEMED）。PAG网孔大小与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰铵的浓度有关。此外，凝胶的机械性、弹性、透明度、粘着度等也与Acr和Bis的比例有关。一般根据分离的DNA分子量大小选择适当凝胶范围。
PAG常规灌制于两块封闭的平板之间，进行垂直电泳，其制备及电泳都比琼脂糖凝胶更费事，但相比之下具有以下优点：①分辨率很强，相差1bp的DNA分子即可分开；②样品槽装载DNA量大，多达10μg DNA而不明显影响分辨力；③回收DNA纯度提高，可适于最高要求的实验；④无色透明，紫外线吸收低，抗腐蚀性强，机械强度高，韧性好。
常用的是两种PAG：
1、用于分离和纯化双链DNA片段的非变性PAG；
2、用于分离和纯化单链DNA片段的变性PAG。
方案一 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
【原 理】
非变性聚丙烯酰胺凝胶，用于分离和纯化小分子双链DNA片段（<1000bp），大多双链DNA在此胶中的迁移率大略与其大小的对数值成反比，但迁移率也受碱基组成和序列的影响，同等大小的DNA分子可能由于空间结构的不同而迁移率相差10%，故不能用它来确定双链DNA的大小。
【试剂及配制】
1、30%丙烯酰胺
丙烯酰胺 29g
N，N'-——甲叉双丙烯酰胺 1g
加水到100ml，加热至37℃溶解，室温避光保存，贮存期间检查溶液的pH值≤7.0。
2、5×TBE（pH8.3）
Tris碱 54 g
硼酸 27.5 g
0.5mol/L EDTA(pH8.0) 20 ml，加水定容至1L。
3、10%过硫酸铵（AP）： AP 1g 加水定容到10ml，4℃下可贮存数周。
4、TEMED
5、DNA分子量标准
6、6×凝胶加样缓冲液
0.25% 溴酚蓝
0.25% 二甲苯青FF
30% 甘油
【操作步骤】
1、用洗涤剂浸泡玻璃板、填条和梳子，必要时用KOH/甲醇清洗（100ml甲醇加5g KOH配制），水洗后再用乙醇淋洗。每块玻璃板的一面都用聚硅氧烷溶液处理，以防凝胶与玻片贴紧并减少电泳完毕后卸胶时凝胶破裂的可能性。
2、装好灌胶用的玻璃片及填条，用琼脂糖封好底、左、右三边。
3、依所分离的DNA的大小来确定合适的凝胶的浓度，参见表：

制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积

4、每100ml胶液中加入35μl TEMED，迅速混匀，用注射器注入胶床，插入梳子，应密切注意胶内不要有气泡，检查有无凝胶渗漏。