图2. 3个癌症组和正常组受试者血清多肽表达谱数据选择和比较分析。 (A) 各个癌症组分别与对照组进行Mann-Whitney U检验。只有校正P值小于0.00001的峰才能进入第二次筛选（峰强度中位数值> 500单位）：如果可以通过1个癌症组或对照组的阈值，则此峰入选。(B) Venn图显示一个癌症组中强度升高或降低的多肽的总数目。(C) 3个癌症组和对照组选定特征的热图的多元或二元比较。柱表示每组样品数；横排为m/z峰（非以数字表示）。二元比较中所用的肽段为各组中特别升高或降低者：多元热图包含有组合的、不可归还的多肽数目。多级膀胱癌和乳腺癌热图的比例尺为标准化的强度，范围为从0（绿色）到500（红色），中点为250（黄色）；前列腺癌的热图为从0（绿色）到2000（红色），中点为1000（黄色）。

　　为达到这一目的，我们利用了目视检测光谱重叠、肽离子相对强度比较和统计分析，对106例晚期前列腺癌、膀胱癌和乳腺癌以及健康人的血清样本测得的精确的肽表达模式的数百种特征性参数进行分类，以寻找最具有预测性的几种关键性多肽。我们发现，将关键性多肽的范围大大缩小至易于识别的少数（如仅限于特征肽段）后，并未对分级预测产生不利影响。MS或基于MS的序列识别技术识别的61种特征性肽段，均为血液中高丰度蛋白的降解产物或相关产物。通过分析疾病与蛋白水解模式的关系，我们发现，胞外蛋白酶的活性与体内蛋白质结合及补体降解途径一起，不仅对癌症特异性多肽的产生有影响，还影响到癌症类型特异性血清肽段的产生。

结果

对基于MS的血清样本中651个肽离子信号的无监督分析，可区分三类癌症和正常对照

　　我们分析了本研究所采用单标准临床规范收集到的73例癌症患者（其中晚期前列腺癌32例，乳腺癌21例，膀胱癌20例）及33例正常志愿者的血清样本^[29]。年龄分布、性别及临床特征见补充表1（本文章的补充资料可在线查阅doi:10.1172/JCI26022DS1)。 收集到的样品采用统一方案处理，包括2次冻融后进行初次保存，随后抽样进行蛋白质提取和MS分析^[29]。全部106个血清标本作为同一批样本，利用专门的样品处理系统进行全自动处理（包括采用包被C8的磁珠进行肽段提取，洗涤，洗脱，与基质混匀，上于MALDI靶板）后， 在1小时内进行MALDI-TOF MS自动分析（参见补充方法）。在同日内按照以往报告方法进行分析、计算机校准和目视检测12个参考样本/谱，以验证系统的重复性和再现性（参见补充方法）[18,29]。在随后的处理和分析过程中，将取自不同癌症患者和正常人的血清标本进行随机分配，采用专用的entropycal程序将处理后的质谱图对齐后^[29]，在700–15,000 Da的范围内共获得651个不同的质量与电荷比值（m/z值）。对每个标本的651个峰强度进行标准化（信号强度减去本底，除以相应谱的总离子流，再乘以换算系数107)后，逐个进行无监督的平均-连锁系统聚类分析。二元和多元比较结果表明，患者与正常人及不同类型的实体瘤之间，肽段表达模式迥然不同（见图1）。

　　图3. 3个癌症组和正常组受试者血清肽表达谱选定峰的MALDI-TOF质谱图重叠。谱图按照方法部分所述获得后，进行匹配和标准化，以质谱图浏览器显示。除2021.05（为大量的无组间差异的肽离子的代表）外，选定可代表组间差异的肽离子的标准化强度。24处重叠区各代表一个癌症组与对照组的谱图的二元比较结果（膀胱癌：n = 20， 绿色；前列腺癌：n = 32; 蓝色；乳腺癌：n = 21; 红色；对照组：n = 33; 黄色)。其排列方式允许经标准化后换算成同样大小的3个二元比较结果可在同样的质量范围窗内显示，各肽离子峰显示的均为单同位素峰。