western蛋白样品最多可以反复冻融几次
可反复冻融的次数具体情况根据目的蛋白性质（主要是稳定性）而定，当然，最好是一次成功。如果说需要做大量的实验，需要一次准备很多一致性蛋白样品，那么强烈建议你在第一次冷冻前用EP管分装，分装数量和分装量根据你的实验次数和需要一次上样量确定。这样，就完全避免了多次冻融（除了第一次实验不需要冻融；这是从根本上解决你的问题）。
再说你提的问题本身，上面也说了，蛋白样品可反复冻融的次数，要根据目的蛋白性质（主要是稳定性）而定，这是说如果你需要的目的蛋白比较稳定，那么，是可以多次反复冻融的，但最好不要多于3次，因为蛋白质在反复冻融下，会变性，而且，储存时间太长了，也会影响实验数据的准确性。一般而言，-20度保存，不要超过2周，最长不要超过1个月；-80度（或-70度）保存，一般不超过半年，最多1年。提一句，新取得样本，如果不是立即提取蛋白，最好立即保存在液氮中（很方便），尤其是如果你还要做RNA实验的话，因为只有在液氮的超低温环境下，才能抑制RNA酶的活性，而RNA酶是无处不在的。
如果是做非变性western的话， 或者是研究蛋白质间的互作（如细胞信号转导），如IP等， 那么最好是用新鲜的蛋白，因为反复冻融会严重破坏蛋白的空间结构和结合蛋白。还有一些小分子
和易分解、变构、不稳定蛋白，也应尽量避免多次冻融。
内参蛋白，如GAPDH和β-actin等，都是些比较稳定或者是经过修饰的在胞中稳定表达的基准蛋白，它们和marker蛋白都是比较稳定的蛋白（或者说的蛋白片段），而且在它们的Buffer中，都添加了稳定剂（或者说是变性剂），是可以多次反复冻融的（这在它们的说明书里应该都有说明）。
ERK蛋白，或者说ERK蛋白家族（至少包括5个亚族），是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，是Ras/Raf/MEK/ERK信号转导途径中重要的一个成员，如果您是做信号转导的话，建议您最好是用新鲜蛋白，尽量避免反复冻融。
至于您说的marker转上了而目的蛋白没转上，我想，这要从您的实验本身来分析，因为WB影响的因素太多了。举个例子来说：您的蛋白提取成功吗？蛋白样品合格吗（纯度、浓度，提取液等）？您的样品上样前如何处理的（是哪种电泳？哪种胶？用的哪种Buffer？需要煮吗？需要离心吗？)？您的上样量是多少？您的目的蛋白的理论浓度是多少还是未知？您目的蛋白的大小是多少？您的电泳液合适吗？您的转膜时间合适吗？您的转膜电压或者电流合适吗，您的转膜温度控制在多少？您转膜完成后如何处理的膜？您使用了合适的封闭液了吗？您的选用的抗体浓度合适吗？孵育时间够吗？洗膜液和洗膜时间合适吗？发光时间够吗？等等
