双氧水诱导肿瘤细胞凋亡——双氧水诱导法
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1. 实验目的
通过实验了解细胞凋亡的一般过程和形态特征，了解诱导细胞凋亡的因素；学习和了解细胞凋亡检测的常规手段，掌握利用梯状DNA电泳法鉴定细胞凋亡的方法。
2.实验原理
细胞凋亡是多细胞生物体在发育过程中或在某些环境因子的作用下发生的受基因调控的主动的死亡方式。对于生物体的正常发育、自稳平衡及多种病理过程具有极其重要的意义。细胞凋亡（apoptosis）的概念最早由Kerr于1972年提出，当时用来描述某些类型的细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，主动地结束其生命，最终脱落离体或裂解为若干凋亡小体（apoptotic body）而被其细胞所吞噬的过程。
细胞凋亡的主要特征包括：染色质凝集、质膜出芽、核裂解及凋亡小体的形成。DNA特异性降解成180～200bp或其整数倍片断，通过凝胶电泳形成梯状条带，称为DNA Ladder。由于DNA特异性降解而产生大量3'-OH末端，可被末端脱氧核糖核苷酸移换酶介导的dUTP缺口末端原位标记法（TUNEL）标记，从而产生亮绿色荧光等。
1980年，Wyllie在研究糖皮质激素诱导胞腺细胞凋亡时发现内源性核酸内切酶活化及其引起的一系列形态学和生物化学方面的变化，提出了细胞程序化死亡（programmed cell Death, pCD）的概念。细胞的程序性死亡通常采取细胞凋亡的形式，因此严格地讲细胞凋亡和程序性死亡并不是同一概念。凋亡主要是形态学方面的函义，而程序性死亡则侧重于功能方面。但是通常人们并未加以严格区分而将这两个概念等同使用。
细胞凋亡是多种生理、病理因子参与的由凋亡相关基因启动的细胞程序性死亡过程，其中由氧应激造成大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生以及继发性细胞损伤过程在细胞凋亡中起着重要作用，如电离辐射或紫外线照射产生大量H2O2、OH等。造成的细胞凋亡。有关活性氧诱导细胞凋亡的详细分子机制尚未得到阐明，部分学者根据一些实验提出了相联系关的假说进行了一些解释。
人工诱导细胞凋亡所使用的OH可以通过Fenton反应而得到，即使用Fe2+与H2O2反应而生成。一般在实验室中，采用一定浓度的FeSO4与H2O2进行。该反应经ESR证实可以在30min内持续稳定地产生OH。
3. 实验用具及材料
Hela细胞系、普通光学显微镜、荧光显微镜、载玻片、盖玻片、细胞培养瓶、生理盐水、电泳仪、高速离心机、紫外检测信、超净工作台、二氧化碳培养箱、恒温水浴锅、细胞记数器、DMEM培养基（GIBOCO公司）、溴酚蓝指示液、台盼蓝染色液（20.0g/L生理盐水配制）、DAPI染料、（4,6-diamidino-2-phenylindole）(Sigma公司)、TUNEL检测试剂盒（Boehringer Mannheim公司）青霉素、链霉素、Rnase A、硫酸亚铁（FeSO4）、双氧水（H2O2）、50xTAE缓冲液、PBS缓冲液、裂解液等。
4. 实验方法及步骤
1）细胞培养
Hela细胞培养在DMEM高糖培养基中，接种密度为1×104个/mL。培养基含有体积分数10%的胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素。细胞在37℃、体积分数5%CO2的条件下进行培养。定期观察、传代。当细胞生长到对数期时进行诱导凋亡的实验。
2）细胞凋亡的诱导
培养的细胞处于对数生长期时，在无菌操作台内将一定浓度的FeSO4与H2O2加进培养瓶。细胞处理的参考浓度如下：
组别 FeSO4/umol/L H2O2/umol/L
对照组 0 0
处理1 100 300
处理2 100 600
处理3 100 900
3）细胞凋亡的检测
（1）台盼蓝染色（Typan blue）检测细胞死亡率
因为生活状态的细胞，其细胞结构完整，所以台盼蓝染料分子不能进入细胞内部。在光学显微镜下观察细胞不着色。而坏死细胞的细胞膜出现破裂或细胞膜通透性提高，台盼蓝染料可以进入细胞内部，因此死亡的细胞呈蓝色。细胞在凋亡过程中膜系统保持完整，因此台盼蓝染色细胞保持无色。
方法：①将培养的Hela细胞取出，加2～3滴细胞悬液于干净的载玻片，滴加一滴台盼蓝染色液，染色1min后即可在显微镜下观察。②选定细胞分散良好的视野，进行细胞死亡率的统计
细胞死亡率=死亡的细胞数目/统计的所有细胞数目
（2）DAPI荧光检测
利用DAPI染料与细胞核内的DNA的结合，在紫外光的激发下发出荧光。因而在荧光显微镜下可以检测细胞核形态的变化。
① 将生长在盖玻片（预先用1mg/mL多聚赖氨酸处理）上的细胞进行Fe2+/H2O2的诱导。
② 用预冷的D-Hanks液洗2遍。
③ 甲醇固定30min。
④ 用D-Hanks液洗1遍。
⑤ 加入1μg/ml DAPI染料染色30min。
⑥ 在荧光显微镜下，UV波段进行荧光检测观察。
（3）TUNEL检测（末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP切口末端标记检测）
凋亡的细胞中，由于启动了内源的核酸内切酶在核小体间进行切割，因此其DNA产生子大量的3’-OH末端，在末端脱氧核糖核苷酸移换酶的作用于下通过催化dUTU的聚合而结合在裸露的确良3’-OH上，经荧光素标记后，在显微镜下进行观察，TUNEL反应阳性的细胞发出亮绿色的荧光，而正常的或坏死的细胞很少产生3’-OH末端，因此呈阴性。
① 将生长在盖片上的细胞经不同浓度的FeSO4和H2O2处理后，用预冷的D-Hanks液洗涤2遍。
② 用配制的体积分数4%的（溶于D-HankspH 7.4）多聚甲醛的室温下固定30min，然后用D-Hanks液洗涤3遍。
③ 在预冷的穿透液中渗透2min，然后用D-Hanks液洗涤3次。
④ 加入50μL TUNEL的反应混合液（5μL末端转移酶和45μL荧光标记核酸混合液）在37℃下于湿盒中反应60min。
⑤ 用D-Hanks液洗涤3遍后，用1：1的甘油-PBS封片，在荧光显微镜下进行观察，照相记录。
（4）DNA Ladder的检测
在细胞凋亡过程中由于限制性内切酶被激活，细胞核DNA在核小体间发生特异性降解，形成180～200bp或其整数倍的片段，经过琼脂糖凝胶电泳后呈现出梯状条带，即DNA ladder这一现象被视为细胞凋亡发生与否的典型特征。
①收集经处理、培养的细胞，用预冷的D-Hanks液洗涤3遍。
②以500g离心10min，弃掉上清液。
③在沉淀中加入预冷的裂解缓冲液。使细胞充分悬浮，然后在冰上裂解90min。
④以1200g离心10min。
⑤将上清液转移到另一Eppendorf离心管中，加入等体积的酚/氯仿，并充分混匀，在4℃下放置1h。
⑥10000g离心30s。
⑦将液相转移到一新的Eppendorf离心管中，加入终浓度为2mol/L的醋酸氨，两倍体积的无水乙醇，-20℃下静置过夜。
⑧12000g离心10min。
⑨真空干燥后，加入50μL无菌水溶解DNA。
⑩加入Rnase A（终浓度为1mg/mL），37℃下消化1h。
(11)取20μL样品与上样缓冲液按体积比5：1进行混合，以15.0g/L的琼脂糖电泳（凝胶中含有终浓度为0.5(μgEB/mL)，电泳条件为1×TAE缓冲液，电压5V/cm，当溴酚蓝指示液移出3～4时停止电泳，在紫外检测仪中进行观察和照相记录。注意：EB（溴化乙锭）有毒，应妥善处理使用过的琼脂糖凝胶并加强自我防护。
5. 作业及思考题
（1）什么是细胞凋亡（apoptosis）?细胞凋亡与细胞坏死（necrosis）有什么区别？
（2）研究细胞凋亡与人类健康有什么联系？
（3）根据本实验结果计算不同处理情况下的死亡率和凋亡率，找出诱导细胞凋亡效率较高的处理浓度。
附录I D-Hanks原液
氯化钠 80.0g
磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O） 0.6g
氯化钾 4.0g
磷酸二氢钾 0.6g
三蒸水 1000mL
附录II D-Hanks工作液
D-Hanks原液 100mL
三蒸水 896mL
0.5%酚红液 4mL
附录III PBS缓冲液（pH 7.4）
K2HPO4 1.392g
NaH2PO4·H2O 0.276g
NaCl 8.770g
溶于90mL蒸馏水，以0.01mol/L KOH将pH调至7.4，最后定容至1000mL。
附录IV 50×TAE缓冲液
Tris碱 242g
冰醋酸 57.1mL
0.5mol/EDTA 100mL
加蒸馏水至 1000mL
附录V 0.5mol/EDTA
Na2EDTA·2H2O 186g
dd H2O 700mL
搅拌均匀，边搅拌加入NaOH固体，调节pH值，当接近pH 8.0时才充分溶解（约需NaOH 20g），定溶至1000mL。
附录VI 裂解缓冲液
20mmol/L Tris-HCl pH 8.0
10mmol/L EDTA pH 8.0
5.0g/L Triton X-100
附录VII 穿透液
1.0g/L Triton X-100
1.0g/ 柠檬酸钠
附录VIII DAPI染色液（100μg/mL）
DAPI（4’-6二氨基-2-苯基吲哚）1mg
滴加几滴甲醇助溶
加水至10mL
等量分装于Eppendorf管内，用锡箔纸包课存于-20℃冰箱中，可存1年。
工作液用PBS缓冲液稀释至所需浓度。工作液在4℃下可保存数周。
附录IX 血球记数板的使用方法
血细胞记数板有两个室，每个室含有9个大方格。当盖上盖玻片后，每个大方格的容积为1.0×10-4mL。将细胞悬液用毛细管移入盖上盖玻片的记数板后，对2个室内的各5个大方格内的细胞进行计数，所得结果即为1×10-3mL中的细胞数目。将此数据乘以1000，再乘以细胞稀释倍数就得到每毫升细胞悬液的实际细胞数目
