用高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体
实验概要
本实验介绍了高效液相色谱(HPLC)纯化小鼠腹水中单克隆抗体的原理及操作步骤。
实验原理
从小鼠腹水中纯化mcab的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲合层析等。应用tsk deae-spw离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化mcab不仅纯化速度快，回收率和得率高，而且保持良好的生物学活性。
根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含mcabγ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。
主要试剂
1. PBS，缓冲液a和b
2. 饱和硫酸铵溶液
3. tris缓冲液
4. 醋酸钠
主要设备
1. tsk deae spw离子交换层析柱（75mm×7.5mm，bio rad）
2. 高效液相色谱仪（包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统）
3. 高速离心机
4. 紫外分光光度计
实验材料
小鼠腹水
实验步骤
1. 腹水离心10000 g，10min，除去细胞和杂质，在4℃下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为40%饱和硫酸铵；
2. 搅拌20～30min；
3. 离心，沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液a（pH8.5， 20mmol/l tris缓冲液）透析除盐；
4. 4℃过夜；
5. 用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液a液平衡的tsk deae spw离子交换层析柱；
6. 洗脱流速1ml/min；
7. 0～1min ：0→5%缓冲液b（20nmol/l tris， pH 8.5，含2.0 mol/l醋酸钠）；
8. 1～2 min（线性梯度洗脱）：5→20%缓冲液b；
9. 20～22min：20→0%缓冲液b；
10. 洗脱液用紫外280nm进行监测；
11. 收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定。
注意事项
1. 所用缓冲液和加样粗提物均需0.2μm滤膜过滤。
2. 在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11-12min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性mcab 的存留时间（retention time）有所差异。
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