烟草中多种添加物的鉴定
德国柏林Charite法医研究所的科学家们会同瑞士同行一起，研究了如何对香烟中范围宽广而化学性质各异的不同物质进行有效的检验。阅读本文之后，您就会知道为什么要决定采用气质与顶空固相微萃取GC/MS HS-SPME相结合的分析方法。
烟草是允许含有添加物的。根据烟草产品的管理规定，甚至可以添加多达数百种物质，其中包括糖（Glycole）和虫胶作为粘合剂，氯化铝（氯化铵），还有浓缩甘草汁、可可、茶叶、咖啡，以及保湿剂，例如甘油或者丙二醇等。
中立的科学家们指出，有几种添加物可能导致香烟潜在毒性的提高。它们可以直接影响尼古丁的吸收，从而强化烟瘾。其中有几种芳香化合物会燃烧形成有毒的反应产物。“这仅仅是可能酿成的后果而已”，Fritz Pragst教授认为，“立法人员要对这些添加物另外作出决定。”柏林Charite法医研究所毒物学研究人员与该所Careen Pietsch博士以及瑞士同事们一道，发展了一种分析方法，可以用来对香烟中89种重要的添加物进行有效和灵敏地测定。
选用样品预处理方法
为了鉴定香烟中的添加物，根据其特性采用了与适当的检测器相结合的气相色谱方法。鉴于复杂的烟草基体和添加物的化学多样性，在样品预处理时不可能采用通用的灵丹妙法。
图1 某香烟样品的总离子色谱图。应用HS-SPME 和 GC/MS方法进行测定。（采用SPME-纤维有65μm CW-DVB, 65μm PDMS-DVB, 100μm PDMS 和85μm PA, 使用前经碱处理。）
Pragst教授认为：“常规的方法诸如蒸汽蒸馏法、溶剂萃取法、捕集吸附法或者上述技术的联合都显得工作强度过大。而且由于所加入的添加物的浓度很小，方法的灵敏度也不能满足要求。”
与此相反，顶空固相微萃取HS-SPME方法已被成功地应用于大多数样品基体中对具挥发性和难挥发性的物质进行GC/MS分析前的样品预处理和进样过程之中。该法操作简易，而且还减少了溶剂的使用。柏林的科学家们确定：“这种HS-SPME方法还能够采用一种唯一的不用溶剂的步骤，对样品进行采样、萃取、浓缩和完成进样。”
专业文献中已经大量报道过将HS-SPME方法用于烟叶和香烟分析。“可是大多数情况下方法仅限于为数不多的几种物质，例如有机酸、烷基苯、香豆素、胡椒醛、长叶薄荷酮以及C1–C4的醇的乙酸酯，或者仅限于调味添加物。多元酚则采用HPLC和电喷雾离子化-质谱法进行检测”， Pragst教授这样总结道。
寻找合适的分析方法
由于香烟的添加物在化学性质上各不相同，有的为碱性，有的为中性，还有一些为酸性。所以不能指望将所有这些物质仅凭唯一的一次气相色谱分析过程全部加以检出。如果要实现这一目标，只能是开发一种扫描的方法，借助有限的测量次数，将香烟中所用的尽可能多的添加物进行灵敏地测定。为实现这一任务，需要一系列专家的共同努力。柏林Charite法医研究所的毒物学研究者们为此必需找出一种方法，运用那些HS-SPME纤维可以在宽广的范围将尽可能多的不同极性的化合物萃取出来。Pragst教授说：“从检测的物质的数目和信号的强度以及峰形来看，最佳的结果是采用CW-DVB-纤维取得的。”这种选择是通过对一些按照碱性、中性和酸性预处理的组分在其SIM-模式测量中所产生的峰面积进行比较来加以证实的。由Supelco公司提供的毛细管气相色谱柱PAT-5获得了最好的结果。这是一种经过特殊处理、基质去活了的聚合柱（5%二苯基/95%二甲基硅烷），原本用于分析胺类以及其它碱性溶质。
科学家们制备了不同pH值的样品溶液。所用的香烟选自55种不同的包装和32种品牌。在分析时间和萃取结果之间，选择了在95℃ 吸附15 min作为折衷方案。 为考察烟叶用量对于HS-SPME方法的影响，采用了加入2，6-甲苯作为定量分析的内标物质。
图2 某市售香烟的总离子色谱图，应用HS-SPME 和 GC/MS方法进行测定。样品预处理方法：（a）碱性，（b）中性，（c） 酸性（峰1 – 89 排位情况见 Journal of Chromatograohy A,1116(2006) 10-19）。
Pragst教授说：“实验表明：随着烟叶量的增加，2，6二甲苯的峰面积强烈降低。”甚至对于其他组分，如2-乙基-1-正己醇或者吲哚在烟叶量增加的情况下，也能确定峰面积变小。究其原因可归结为有限的纤维容量效应。色谱图显示出高强度的基线背景，因而，在检测较小的信号时，不能得到足够的灵敏度。实验表明，采用50mg样品量时为最佳。
实际样品的应用
由柏林Charite法医研究所研发的这种HS-SPME GC/MS方法已被用于大量香烟品牌的研究中。为了进行比较，采用了不同的烟草原料和两种加入了不同添加物的香烟来进行。采用同一种品牌和批次的大量香烟经混合和匀质化而制备的代表性样品则没有进行分析。未曾料到的是，所进行的定性和定量的双份检测结果显示出同样的加合特性。Pragst教授证实：“在单一的一支香烟和一包香烟之间所产生的浓度差别小于20%。”
对于每种香烟，都要采用双份的HS-SPME GC/MS方法对其碱性的、中性的和酸性的样品悬浮液进行分析。质量扫描在m/z= 45~400范围内进行，每一个峰都要采用Wiley 和NIST数据库进行对照。Pragst教授进一步指出，采用他们自己研发的数据库可以更好地分析所得到的谱线。为证实起见，将保留时间和质谱图与相应的参考物质在相同条件下得到的数据来进行比较。
研究人员一共鉴定了89种重要的组分，其中包括天然的烟草成分，如尼古丁和其它的烟草生物碱以及一些在生产香烟时添加进去的调味品、保湿剂和蓬松剂。通过将市售香烟的色谱图与参照香烟和烟草原料的色谱图进行比较，就可以判断哪些组分是纯天然的，而哪些是人工添加进去的，其中挥发性乙醛和酯是在芳香、调味品和食品工业中经常添加的组分。Pragst教授认为：“γ- 壬烷内酯，属于一种已知的椰子醛，以及γ- 十一烷内酯（桃醛），赋予甜蜜和湿润的特性。薄荷和佐料的味道则是通过异胡薄荷醇、百里酚和薄荷醇产生的。甘油三乙酸酯、丙二醇或三聚丙二醇是作为辅料加入的，用作蓬松剂，赋予醚香油成分或作为烟叶湿润剂之用。一次实验中还发现了6-甲基豆香素， 一种人工合成的带有甜味的椰子香精。”
定量分析保安全
薄荷醇、2-乙基-1-己醇、苯甲醇、苯甲醛、苯乙酮、吲哚、吡啶和糠胺本是天然存在于烟叶中的组分，但在生产香烟的过程中会部分损失掉。为保持烟草的原汁原味，这些组分也会作为添加物而加入。为了区别是天然成分还是添加物，进行定量分析是必要的。定量分析的结果证明了我们科学家的观点是正确的。在香烟中发现的薄荷醇、2—乙基-1-己醇、苯甲醇的浓度明显高于在烟叶原料中测定的数值。举例来说，在某非薄荷醇香烟中测得薄荷醇的浓度要比烟叶原料中的薄荷醇高出100倍之多，比参考香烟也高出近40倍。在2-乙基-1-己醇也得到相似的结果，其浓度要比参考香烟的值高出170倍。
研究结果表明：HS-SPME 与GC/MS 和质谱数据库相结合的方法可以成功地应用于香烟的例行分析中，对数量众多的碱性、中性和酸性的香烟添加物进行扫描。由于香烟中大多数添加物为半挥发性组分，所以这种HS-SPME 预处理技术特别适用。另外，还应指出，这种方法通过定量检测，可以检验香烟是否符合所规定的添加物的最大允许浓度，以及控制天然组分的人为添加量。
