阶段 3:mRNA 的提取

材料

缓冲液与溶液
按合适比例稀释贮存液。

DEPC 处理水

乙醇

NaCl(5mol/L)

酚

酚：氯仿

无二价阳离子的磷酸缓冲液（PBS)

SDS(5%m/V)

TMK 缓冲液
10 mmol/LTris-HCl(pH7.5)
10 mmol/LKCl
1 mmol/LMgCl₂
Triton X-100(10%V/V) 或 Nonidet P-40(4%，V/V)

离心转头

Sorvall H1000B 转头或等同规格转头

专用设备

细胞刮子或橡胶刮

聚苯乙烯离心管（15 ml), 冰上预冷至 0°C

细胞与组织

分别经重组 pSPL3 和非重组 pSPL3 转染的 COS-7 细胞

方法

1. 用冰预冷的不含钙、镁离子的 PBS 洗涤平皿中的转染 COS-7 细胞三次。洗涤过程中将平皿保持在冰上。

2. 每个平皿中加入 10 ml 预冷的 PBS。保持平皿在冰上，小心的将细胞刮除下来。

3. 将细胞悬液转入预冷的 15 ml 聚苯乙烯离心管中。
使用透明的聚苯乙烯离心管，有利于步骤 8、9 中不含细胞核的胞浆的回收。

4.4°C、300 g（Sorvall H1000B 转头上相当于 1200r/min) 离心 8 min 回收细胞。

5. 尽可能倾去上清，并用加样器除去残存的上清。

6. 在 300ulTFK 缓冲液中重悬 1X106 至 2x106 的 COS 细胞，冰上放置 5 min。

7. 加入 15ul 的 10% 的 Triton X-100 或 4% 的 Nonidet P-40, 冰上放置 5 min。
加入非离子去污剂可导致质膜的轻微破解而核膜保持完整。

8.4°C、500 g(Sorvall H1000B 转头上相当于 1500r/min) 离心 5 min 沉淀细胞核。

9. 将上清移入预冷的 1.5 ml 小离心管中。
重要：移取上淸时应异常小心，切不可触及细胞核沉淀。如核膜破裂会导致基因组 DNA 污染，样品将非常黏期而难以吸取。

10. 加入 20ul 的 5%SDS 和 300ul 的酚，剧烈振荡后最大速度离心 5 min，样品将分为有机相和水相。

11. 将水相移入含 300ul 酚: 氯仿的 1.5 ml 小离心管中，剧烈振荡后室温最大速度离心 3 min 进行分相。

12. 移取上层的水相至预冷的 1.5 ml 小离心管中，加入 120 的 5mol/LNaCl 和 750ul 的乙醇。-20°C 放置 2~3 h 或-80°C 放置 30 min 以沉淀 RNA。
核酸在乙醇中比在水中更稳定。如长期保存，RNA 应置于乙醇中-80°C 冻存（见第 7 章，方案 1 结尾部分的专栏“RNA 的保存"）。

13.4°C、最大速度离心 10 min 回收 RNA。

14. 弃上清并用 70% 乙醇洗涤沉淀。空气干燥后，将沉淀重悬于 20 g 的 DEPC 处理水中。

阶段 4: 反转录 PCR

材料

缓冲液与溶液
按合适比例稀释贮存液

10x 扩增缓冲液

氯仿

DEPC 处理水

DTT(lmol/L)

dNTP 溶液，每种核苷酸浓度为 1.25 mmol/L

酚

RNase 抑制剂

酶及缓冲液

Bst XI

EcoR V

Mo-MLV 反转录酶

Taq DNA 聚合酶

DNA 尿嘧啶糖基酶（1 单位/ul)



凝胶

琼脂糖凝胶（1.5%m/V), 用 TBE 配制

核酸与寡核苷酸

寡核苷酸引物 [20 mmol/L,TE(pH8.0) 配制]


分别提取自转染有对照载体和重组载体的 COS-7 细胞的 RNA(阶段 3)。

培养基

含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板

专用设备

自动微量加样器所用的加样器尖头

微量离心管（PCR 扩增用 0.5 ml 薄壁离心管，无 RNase）

带退尖头装置的自动加样器

可设置方案中反应程序的热循环仪
如热循环仪无热盖. 使用矿物油或封口石蜡防止 PCR 反应混合物的蒸发。封□石蜡不仅可防止蒸发，还可起到在反应混合物加热之前使反应组分（如引物与模板）暂时隔铯的效果。这可防止在反应的起始阶段由于引物非特异的结合模板引发的扩增。

预设溫至 42°C、55°C 和 65°C 的水浴

附加试剂

本方案步骤 14 需要的试剂列在第 1 章，方案 25。

载体与菌株

大肠杆菌 DH5α(或其他可产生α互补的菌株）

载体 pBluescriptⅡ(KS 或 SK)(Stratagene 公司）

方法

cDNA 的合成

1. 以 SA2 寡核苷酸作为引物，用步骤 3 中获得的胞浆 RNA 作模板制备 cDNA 第一链。

在 1 个无 RNase 的 0.5 ml 离心管中混合以下试剂:
RNA                                                  3ul
10x 圹增缓冲液                                2.5ul
dNTP 溶液 (每种 1.25 mmol/L)         4ul
0.1mol/LDTT                                    1ul
3'引物（SA2,20umol/L)                    1.25ul
DEPC 处理水                                   11.25ul
将反应混合物 65°C 放置 5 min。
重要：为降低 RNA 中二级结构的形成，不要将反应混合物放置于冰上。

然后加入：
RNase 抑制剂                                         1ul
Mo-MLV 反转录酶（200 单位）              1ul
42°C 温育 90 min。

2. 同时使用寡核苷酸引物 SA2 和 SD6 进行 cDNA 第二链的有限合成。在一个无菌的薄壁离心管中混合以下试剂：