间接原位PCR(原位杂交PCR)
与直接原位PCR所不同的是,靶基因在扩增时不进行标记基团的掺入,而是标记一段与扩增片段互补的探针,在扩增结束后,应用此探针进行原位杂交。因此,此处主要介绍原位杂交,其余方法同原位PCR。
实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、预杂交 1. 试剂与配制 2×SSC 50%去离子甲酰胺:用4×SSC配制(v/v) 预杂交液:2×SSC,5%硫酸葡聚糖,50%甲酰胺,0.2%脱脂奶粉 2. 操作方法 (1)在进行完原位PCR扩增后,用2×SSC预浸经乙醇脱水、空气干燥的玻片,并简洗15 min; (2) 用50%去离子甲酰胺37℃孵育15 min; (3)加预杂交液20 μl/片,在杂交温度下孵育30 min~2 h。 二、杂交 1. 试剂与配制 杂交液:50%去离子甲酰胺,5×SSC,10%硫酸葡聚糖,5×Denhardt’s 液,2%SDS,10 mg/ml变性的鲑鱼精DNA 2. 操作方法 (1)弃预杂交液,加杂交液(含0.2~5 μg/ml探针)10~20 μl/片,覆盖经硅化的盖玻片,石蜡膜封片或橡皮泥封片; (2)玻片置于湿盒中,42℃杂交12~18 h(过夜,但不能超过24 h)。
三、杂交后处理 1. 试剂与配制 2×SSC Rnase(20 μg/ml) 50%去离子甲酰胺 10 mmol/L DTT 2. 操作方法 1. 杂交完毕,用2×SSC浸泡玻片数分钟,轻轻移去盖玻片,再用2×SSC洗玻片1~2 min; 2. 2×SSC(含20μg/ml RNase,适宜RNA探针,DNA探针可省略此步)中洗片30 min,37℃; 3. 2×SSC/50%去离子甲酰胺,42℃×10 min; 4. 1×SSC/50%去离子甲酰胺,37℃×30 min,2次; 5. 4×SSC/10 mmol/L DTT洗1 h; 6. 0.1×SSC洗2次,每次37℃×30 min; 7. PBS中洗10 min,即可进行显色,方法同上。 收起 |
注意事项 | 1. 如果检测mRNA,双链探针应变性处理,方法是95~100℃加热10 min后迅速置于冰中骤冷; 2. 以单链探针检测DNA时,DNA也需变性处理,将玻片置于70~80℃变性液(70%去离子甲酰胺,即甲酰胺/2×SSC,v/v)中10 min; 3. 用双链探针检测DNA时,可按上述方法变性处理。 |