改进碱性苦味酸法在血清肌酐测定中的应用

【摘要】  目的：提高血清肌酐测定的准确性。方法：用双液体试剂中的RI液和标本进行反应，使胆红素氧化成胆绿素，再进行肌酐的测定，并与原法对比。结果：原法受胆红素的干扰，双液体两步法可有效消除胆红素的影响。结论：双液体两步法消除了胆红素对肌酐测定的干扰，操作简单，结果可靠，经济实用，适合推广。

【关键词】  碱性苦味酸法;肌酐;胆红素

血清肌酐(CREA)测定是临床中常用的检测项目，也是急诊肾功能检测项目之一。血清肌酐值是评价肾小球滤过率(GFR)及诊断急性、慢性肾功能衰竭的有效指标。目前，我国临床实验室测定血清肌酐的方法主要有两种：一类是碱性苦味酸法，另一类是酶学测定法。酶法试剂价格昂贵，尚不能达到普及，碱性苦味酸法是目前主要肌酐测定方法[1]。但这种方法的主要缺点是受高胆红素负干扰而致结果明显偏低，甚至出现负值。现将双液体试剂反应步骤进行了改进，把原来的一步法改为两步法，可有效地消除胆红素对肌酐测定的负影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂：碱性苦味酸试剂(试剂R1：320 mmol/L氢氧化钠;试剂R2：35 mmol/L苦味酸，北京中生提供)。肌酐标准液、高、低定值质控血清由英国朗道提供。仪器使用日立7180型全自动生化分析仪。

1.2 方法：①10 μl血清[总胆红素(TBIL)408 μmol/L]与200 μl试剂R1(320 mmol/L氢氧化钠)混合后，连续检测该混合物分别在510 nm和620 nm处吸光度的变化。结果发现48 s以后510 nm吸光度下降缓慢或基本不变，而620 nm处吸光度在32 s后上升缓慢或基本不变。胆红素被氧化成胆绿素的反应主要发生在标本和RI液混合后50 s以内。②根据上述发现并结合日立7180型全自动生化分析仪的特点，调整反应参数。10 μl血清与100 μl试剂R1(320 mmol/L氢氧化钠)反应16 s后加入100 μl试剂R2(35 mmol/L苦味酸)，在试剂R2加入后16 s读取起始吸光度(A1)，再过48 s读取终末吸光度(A2)，计算时用A2-A1=ΔA。肌酐的含量为:肌酐(μmol/L)=样品ΔA/标准ΔA×标准浓度(μmol/L)。主波长510 nm，副波长660 nm，反应温度37 ℃。

2 结果

2.1 两种检测方法的比较：选取低值定值质控血清(TBIL 19.2 μmol/L、CREA 93 μmol/L)、高值定值质控血清(TBIL 132 μmol/L,CREA 435 μmol/L)分别用一步法和两步法在日立7180型全自动生化分析仪各连续测定测定肌酐浓度20次。低值定值质控血清经配对t检验，t=0.53,P>0.05,差异无统计学意义;高值定值质控血清配对t检验，t=9.49，P<0.05,两者差异有统计学意义。表1 两种方法测定肌酐浓度精确性比较

2.2 方法的精确性：本方法低(TBIL 19.2 μmol/L,CREA 93 μmol/L)、高(TBIL 132 μmol/L,CREA 435 μmol/L)两种质控血清批内变异系数(CV)依次为4.7%、2.94%，批间CV依次为3.79%、2.06%，两组间比较，说明两步法精密度良好。详见表1。

2.3 回收实验：取3份胆红素121 μmol/L的血清做试验，分别加入肌酐浓度为40.4 μmol/L、21.9 μmol/L、11.0 μmol/L，测得回收浓度分别为38.5 μmol/L、21.3 μmol/L、10.8 μmol/L，回收率依次为95.4%、97.2%、99.8%。

3 讨论

碱性苦味酸速率法测定的原理是肌酐同碱性苦味酸反应，形成一种红色复合物，通常在510 nm处根据测定一定时间(20～80 s)内血清和标准液吸光度的增加量计算肌酐的含量。而胆红素在510 nm处也有较强光吸收，并且在氢氧化钠的作用下，逐渐转化为620 nm处有强光吸收的胆绿素，而胆绿素在510 nm处只有很弱的光吸收，这样就掩盖了肌酐本身的显色反应表现，从而使测定结果偏低，甚至出现负值[2]。现将双液体试剂反应步骤进行了改进，把原来的一步法改为两步法。这种改进后的方法可以有效地消除胆红素对肌酐测定的负影响，提高血清肌酐测定的准确性，操作简单、方便，结果准确，适合临床推广。

【参考文献】

[1] 马恩龙.碱性苦味酸法和酶法测血清肌酐的方法学比较[J].大连大学学报,2004，12(6)：53.

[2] 叶应妩.全国临床检验操作规程[M].第3版.南京：东南大学出版社，2006：466