植物组织培养技术知识汇总（一）
人们利用植物 组织培养技术快速获取优良植物株系、培育作物新品种等方面，那么如何利用植物组织培养技术再生植株呢?如何鉴定与避免与植物组织培养苗的污染，在此，小编总结了有关植物组织培养技术的七大方面，带你领略植物组织培养技术的方方面面。
第一部分 植物组织培养的概念
(广义)又叫离体培养，指从植物 体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
(狭义)组培指用植物 各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
植物 组织培养基础理论
1、植物 细胞全能性
植物细胞全能性(totipotency)是组织培养的理论基础。一个生活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的遗传基础，在一个适当的条件下可以通过分裂、分化再生成一个完整植株，这就是所谓的细胞全能性。
但是在自然状态下，由于细胞在植物体内所处位置及生理条件的不同，它的分化受到各方面的调控，致使其所具有的遗传信息不能全部表达出来，所以只能形成某种特化细胞，构成植物体的一种组织或一个器官的一部分。
由此可以说明条件是十分重要的，或者说是关键的，只要条件合适，细胞潜在的遗传能力就会表现出来。植物组织和细胞培养技术就是以细胞全能性作为理论依据，用人为的方法创造出一个适合于生长的理想条件，使细胞的全能性得以发挥。
从理论上讲，只要是一个生活的细胞，都有再生出一个完整植株的潜力，但实际情况并非如此简单。就目前所知，细胞的再生潜力与其分化程度呈负相关，就是说细胞分化程度越高其再生能力越低，但也有人认为细胞的再生能力与其分化程度无关，只是人们现在还没能完全掌握细胞分化的机制。
虽然还没有完全从理论上揭示其原因，但事实是越老的细胞，其基因的表达就越受到严格的制约，或者说丧失功能或不表现功能的基因越多，所以应尽量选取幼嫩的植物组织作为培养的实验材料。
同时，还应该考虑到，一定的基因型或外植体的再生能力并不是一成不变的，在不同培养条件下，同一基因型或外植体的表现不同，高度分化的细胞或组织只要条件合适，也有产生再生植株的可能，这种可能性能否变成现实，还有待于人们继续努力。
2、细胞分化、脱分化与再分化
(cell differentiation,didifferentiation and ridifferentiation)
一粒成熟的种子含有一个小小的胚，也可以叫做胚胎。构成胚胎的所有细胞几乎都保持着未分化的状态和旺盛的细胞分裂能力，其细胞质浓稠，细胞核较大，细胞与细胞之间没有很大差异，这些细胞都可以叫做胚性细胞，或叫分生性细胞或未分化细胞。在适宜的条件下，随着种子的萌发，构成胚胎的所有细胞即开始分裂活动，增加细胞数目。
随着时间的进行细胞的命运发生不同变化，形态和功能也发生变化，有的形成了叶子的细胞，有的形成了根的细胞，有的形成茎的细胞，有的仍保持分裂能力，有的则逐渐失去分裂能力，细胞的这种在形态结构和功能上发生永久性(不可逆转性)适度变化的过程叫做分化。
分化主要是由细胞内的基因决定的，也就是说分化是基因在时间和空间两个方面差次表达的结果。分化的结果导致细胞分裂能力的丧失，伴随的是细胞的分化、成熟与组织的形成，是植物根、茎、叶、花、果实和种子的形成，是一个成熟植物体的出现。
在正常的自然状态下，这些已经分化的细胞不会再恢复分裂能力重新开始细胞分裂，直到植物体死亡为止。
当把一个已经失去了分裂能力，处于分化成熟和分裂静止状态的细胞置于特定的增殖培养基上时，它首先发生的变化是回复到分生性状态，这一状态包括由溶酶体的活动而将失去功能的细胞质组分降解，并产生新的细胞质组分(即细胞器的破坏与重建)，同时细胞内酶的种类与活性发生改变，蛋白质合成和细胞代谢过程也发生改变，最后引起基因表达的改变，细胞的性质和状态发生了扭转，可以说是返老还童。
由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞团即愈伤组织的现象(或者说是过程)称为“脱分化”(dedifferentiation)。经过脱分化的细胞如果条件合适，就可以长久保持旺盛的分裂状态而不发生分化。
由无分化的愈伤组织的细胞再转变成为具有一定结构，执行一定生理功能的细胞团和组织，构成一个完整的植物体或植物器官的现象(或过程)，叫做“再分化”(redifferentiation)。
一个已分化细胞要表达出其全能性，就要经过脱分化和再分化的过程，这就是植物组织和细胞培养所要达到的目的。设计培养基和创造合适培养条件的主要原则就是如何促使植物组织和细胞完成脱分化和再分化，培养的主要工作就是设计和筛选培养基，探讨和建立合适的培养条件。
植物激素在调节细胞脱分化和再分化中起到主要作用。植物对激素的反应十分敏感，培养基中生长素类和细胞分裂素类的种类、相对比例和绝对量都能直接影响到细胞脱分化和再分化的过程，组培中常常是通过调节激素的种类、浓度和相对比例来达到调节脱分化和再分化的目的。
3、器官发生和胚状体发生(organogenesis and embryogensis)
培养的植物组织与细胞再经过脱分化和再分化再生出新的植物体过程中，特别是再分化时，可经过两条途径，一是由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽(或根)，再在另一种培养基上产生根(或芽)，形成一个完整的植株，因为芽和根都是植物体的器官，所以这一过程叫器官发生途径。
另一个是在愈伤组织中产生出一些与种子中的胚相似的结构，即同时形成一个有苗端和根端的两极性结构，然后再在另一种培养基上同时发展成带根苗，由于这一过程与种子中胚的形成和种子萌发时形成幼苗的过程相似，所以叫做胚状体发生或无性胚胎发生。
组培条件下，植物再生是走器官发生途径还是走胚状体途径，随植物不同而不同，也随培养基的不同而变化，有时甚至同一种植物在同一条件下，即存在体细胞胚胎发生途径，也存在器官发生发生途径，这都是自然现象，是正常的，只是两种发育途径的频率随着基因型不同和培养条件的改变而差异显著。
第二部分 植物组织培养培养基成分组成
化学合成培养基大致由6种成分组成：
(1)糖类，
(2)多种无机盐类，
(3)微量元素，
(4)氨基酸、酰胺、嘌呤：
(5)维生素;生长素。
此外，有些培养基还可添加天然的汁液，如椰子汁、酵母提取液、水解酪蛋白、麦芽浸出液等，培养基中如加入0.5～1%的琼脂即为静止培养的固体培养基，否则为悬浮培养的液体培养基。
不同植物材料常需要改变配方，如维持生长和诱导细胞分裂和分化的培养基配方就不同，因此配方的种类很多，目前以Ms (Murashige and Skoog)培养基配方为最常用的一种基本培养基，它利于一般植物组织和细胞的快速生长。
在进行组织培养研究时应根据研究目的和培养植物的种类来确定培养基的组成，除营养、诱导作用外还应当注意离子平衡和毒性问题，如水一般都采用重蒸馏水，无机盐类一般都需用化学纯的药品， pH值可用1N KoH(或NaOH)溶液和2N HCI调整。
有时可以用普通药品代替，但须注意这些药品不仅应有营养价值，还须无毒。如果在工业上使用大缸深层培养细胞或组织生产有效成分和生物制品、应用培养基的量将要以吨位计量时，则采用什么代用品较为经济实用更应慎重考虑。
第三部分 植物组织培养的培养条件
(一)温度： 对大多数植物组织20～28℃即可满足生长所需，其中26～27℃最适合。
(二)光： 组织培养通常在散射光线下进行。光的影响可导致不同的结果。有些植物组织在暗处生长较好，而另一些植物组织在光亮处生长较好，但由愈伤组织分化成器官时，则每日必须要有一定时间的光照才能形成芽和根。有些次生物质的形成，光是决定三因素。
(三)渗透压： 渗透压对植物组织的生长和分化很有关系。在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。通常1～2个大气压可促进植物组织生长，2个大气压以上时，出现生长障碍，6个大气压时植物组织即无法生存。
(四)酸碱度： 一般植物组织生长的最适宜pH为5～6.5。在培养过程中pH可发生变化，加进磷酸氢盐或二氢盐，可起稳定作用。
(五)通气： 悬浮培养中细胞的旺盛生长必须有良好的通气条件。小量悬浮培养时巨常转动或振荡，可起通气和搅拌作用。大量培养中可采用专门的通气和搅拌装置。
第四部分 植物组织培养材料与方法
从低等的藻类到苔藓、蕨类、种子植物等高等植物的各类、各部分都可采用作为组织培养的材料，一般裸子植物多采用幼苗、芽、韧皮部细胞，被子植物采用胚、胚乳、子叶、幼苗、茎尖、根、茎、叶、花药、花粉、子房和胚珠等各个部分。
由于植物在自然条件下，表面常被霉菌和细菌污染，故材料必须进行灭菌处理。一般用漂白粉溶液(1～10%)、次氯酸钠溶液(0.5～10%)、升汞溶液(0.01%)、乙醇(70%)或过氧化氢(3～10%)等处理后，再用无菌水反复冲洗至净，然后在无菌室内，将所取的组织迅速培养在固体培养基上。
在适宜的条件下，受伤组织切口表面不久即能长出一种脱分化的组织堆块，称为愈伤组织(Callus)，此种愈伤组织在适当的培养基上经一定时间即能诱导生长成整株植物，因此愈伤组织既可是某种植物代谢产物的来源，又是诱导成株的主要途径之一。
在适宜的培养条件下，还可使愈伤组织长期传代生存下去，这种培养称为继代培养。
但在继代培养中，不少植物培养的组织或细胞随着再培养代数的增加，分化能力就逐渐降低甚至丧失，其原因可能是由于在培养过程中原有母体中存在的、与器官形成有关的特殊物质被逐渐消耗所致。
因此可以用激素或改善营养条件使之恢复，也有认为是组织和细胞在长期培养中遗传往的改变，主要是染色体的变化，出现大量多倍性或非整倍性细胞，这种改变恢复的可能住较小。
不同的培养基可以使愈伤组织具有不同的生长速度，结构也可松可紧，利用这些特性可使之分散成为单细胞或很小的细胞团。要形成单细胞培养宜在较高盐分、高生长素及高水解酪蛋白的培养基中进行，然后移入液体并经搅拌而分散成单细胞。
也有用加入一些果胶酶的办法，但一般来说要得到纯一的单细胞是很少的。
在培养药用植物选材时，还应考虑到所需要的次生物质在植物体中的合成部位，如果选材和培养方法适当，可使原植物内所产主的代谢物通过细胞或组织培养发生生化转变而获得。
通过组织培养可获得有效成分，但实际上只有大量培养成功才有经济价值。因此在生产上常采用悬浮培养法来代替含有琼脂的固体培养基。
愈伤组织悬浮培养的生长通常比静止培养快，这是由于悬浮培养时营养成分可较快地渗入细胞，抑制生长的代谢废物可较快地除去，同时供氧情况也较好，在进行这种培养时要注意通气与定期更新营养液，这是保证生长稳定，次生物质产量高的关键之一。
第五部分 植物组织培养再生的步骤
一、接种
组织培养的接种是指将灭过菌的材料，在无菌的情况下，切成小块，放入培养基的过程。科研、生产部门的接种工作，多在无菌室或超净工作台上进行，中学可制作接种箱，在箱内进行接种。接种的方法步骤如下：
1、在无菌室或接种箱中放好接种时所需要的酒精灯、贮存70%酒精和棉球的广口瓶、各种镊子、接种针、解剖刀、手术剪、火柴、培养基等。
2、在无菌室或接种箱内用紫外灯灭菌(无菌室照射20～50分钟，接种箱照射15分钟)。
3、放入已灭菌的接种材料(用培养皿盛取)。同时，操作人员用酒精棉球擦手，并对接种工具用酒精灯火焰烧灼。
4、用手术刀片将材料切割成若干片段，并迅速接种入培养基中。接种时，锥形瓶(或试管)应斜向火焰，在酒精灯火焰附近操作。
5、材料接种好后，将锥形瓶瓶口在酒精灯火焰上转动烧一遍，盖好瓶盖，注明材料名称及接种日期。
材料接种后，应置于26～28℃的培养室中进行培养。
二、植株诱导
本阶段是组织培养中最重要的一环。在培养基中植物激素的作用下，外植体通过三条途径迅速增殖，这就是侧芽增殖、诱导不定芽的形成和诱导胚状体的形成。
1、侧芽增殖
种子植物的每个叶腋中通常都存在着腋芽，在一定条件下可以使它生长。现在知道顶端优势抑制侧芽生长，可被外源的细胞分裂素打破，所以在利用侧芽增殖这条途径时，培养基中几乎都要加入细胞分裂素(有时也加入少量生长素)。
由于细胞分裂素的持续作用，侧芽不断分化和生长，逐渐形成芽丛。如果反复切割和转移到新的培养基上继代培养，就可在短期内得到大量的芽。 侧芽增殖的主要优点是能保持遗传的稳定性，因为茎尖的细胞常是均一的二倍体细胞，它不易受培养条件的影响而发生变异，也易于保持嵌合体的性状。
目前已有近百种植物可以用这种方法进行繁殖，如草毒(Fragaria ananassa Duch.)、苹果、葡萄(Vitis vinifera L.)、唐菖蒲(Gladiolus gandavensis Houtt.)、非洲菊、月季(Rosa chinensis Jacq.)、甜菜(Beta vulgaris L.)和凤梨(Ananas comosus(L.) Merr.)等。
关于培养基中加入细胞分裂素的浓度，是0.1～10.0毫克/升，一般为1.0～2.0毫克/升。在几种细胞分裂素中用的最多的是6-苄基嘌呤，其次是激动素和异戎基腺苷，玉米素用的很少。
除了细胞分裂素之外，在培养基中还经常加入低浓度的生长素以促进腋芽的生长。常用的生长素是萘乙酸、吲哚丁酸和吲哚乙酸(浓度为0.1～1.0毫克/升)。
2、不定芽的诱导形成
在自然条件下，很多种植物的器官可以产生不定芽。在培养条件下，由于所需要的外植体很小又加上激素的作用，可以使这种产生不定芽的能力得到极好的发挥，如秋海棠或非洲紫罗兰(Saintpaulia ionantha Wendl.)用常规的叶插法繁殖时，每片叶只能产生几个到十几个芽，但用叶切段在培养基中可产生成千上万个芽。
在培养条件下，还能使自然条件下不产生不定芽的器官形成不定芽，如卷心菜(Brassica oleracea L.var.capi-tata L.)和番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)的叶、菊花[Dendranthema morifolium(Ram.) Tzvel.]的花和叶片、百合(Lilium brownii F.E.Br.var.viridulum Baker)和水仙的鳞片以及萱草(Hemerocallis fulva L.)的花茎等。 在诱导外植体形成不定芽时，一般使用细胞分裂素高于生长素比值的激素配比，少数情况下也采用二者比值接近1的配比。
常用的细胞分裂素是6-苄基嘌呤，激动素和玉米素，浓度范围一般在0.1～10.0毫克/升。生长素是萘乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸，其浓度范围与细胞分裂素相同。为了使外植体形成不定芽，外源激素的供应只是一个方面，器官分化的性质还要决定于内源激素的状况。
因此，对于不同的植物，使用的激素种类和浓度常有较大的变化。在具体操作时，应参考已有资料或相近种类的已有结果，以确定适当的浓度和配比。
3、胚状体的诱导形成
在自然界只有少数植物可以由珠心产生胚状体。在培养条件下，现在已有30多个科的150多种植物可以产生胚状体。在诱导胚状体的形成时，其外植体一般取自胚、分生组织或生殖器官。
为了获得胚状体，在培养过程中，培养基中应含有丰富的还原氮，并加入生长素(主要是2，4-D)诱导胚状体的发生。待胚状体发生后，要转移到降低浓度或没有生长素的培养基上进行培养，使胚状体成熟和生长。
胚状体途径的优点是增殖率高，而且胚状体既具胚芽又具胚根。因此，可免去生根这一步骤。但目前很多重要作物还不能形成胚状体，或产生的胚状体难以形成植株，另外胚状体遗传性也容易发生变异，所以目前除柑桔(Citrus)、油棕(Elaeis guine-ensis Jacq.)和咖啡(Coffea)等少数作物外，都不采用这一途径。
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