六大病毒载体技术的比较;不同基因传递方法的比较 二
为什么是shRNA?
外源导入的siRNA结合RISC复合物的能力要比shRNA低10倍,虽然将siRNA的长度增加到29-30 nt可以增加结合RISC复合物的效率,但也增加了off target效应,引起更多的非专一性基因干扰。shRNA由于模拟microRNA的作用通路,所以相比siRNA其基因沉默效率更高。siRNA和shRNA的优缺点见表四。锐赛选择使用病毒载体介导的shRNA干扰,并通过构建shRNA稳定株,能最大程度的避免使用体外化学合成的siRNA所带来的一系列问题。
siRNA | shRNA | 双功能shRNA | ||
RNA干扰片段运输 | 进入体外细胞 难易程度 | 中等 (转染效率依细胞而定,差异大) | 容易 (使用病毒载体) | 容易 (使用病毒载体) |
进入动物体内 细胞难易程度 | 低 (转染效率依组织特性而定,且需要较高剂量,可能引起off target效应) | 容易 (使用病毒载体,发挥功能需要的拷贝数低) | 容易 (使用病毒载体,发挥功能需要的拷贝数低) | |
进入细胞的方式 | 化学试剂转染 | 化学试剂转染;病毒载体转导 | 化学试剂转染;病毒载体转导 | |
细胞内代谢速度 | 强(48小时内99%被降解) | 弱 | 弱 | |
作用机制 | 结合RISC复合物能力 | 弱 | 强 (10倍强于siRNA) | 超强 |
达到沉默效果需要的拷贝数 | 高 | 低 (5个拷贝左右即可) | 超低 | |
脱靶效应 (off target effects) | 化学修饰能力a | 易修饰;修饰价格昂贵 | 无法修饰 | 无法修饰 |
免疫信号通路反应 | 中 (通过细胞质和内涵体通路激活先天性免疫系统) | 弱 (由于使用与内源miRNA相似的干扰系统) | 弱 (由于使用与内源miRNA相似的干扰系统) | |
外源核酸对细胞的毒性 | 中 | 弱 | 弱 | |
对细胞内源RNA干扰系统的影响 | 中 (过量siRNA会增加饱和exportin-5运输内源miRNA能力的风险性) | 中(瞬时转染引入的高剂量shRNA会增加饱和内源miRNA降解能力的风险性),低(稳定转染) | 中(瞬时转染引入的高剂量shRNA会增加饱和内源miRNA降解能力的风险性),低(稳定转染) | |
表达可调控性 | 可控表达程度 (时间和空间) | 低(可以通过结合特定的小分子或者大分子达到特异进入某类组织细胞的目的,但无法做到可诱导沉默) | 高 (更换启动子) | 高 (更换启动子) |
安全性 | 体外和动物体内 | 高 | 高 | 高 |
临床 | 中 | 中 | 中 |
a: 1) 改善off target效应; 2) 提高细胞内稳定性
表六:不同转染方法介导的稳定整合参数比较
稳定整合参数 | 化学转染法 | 物理转染法 | 病毒载体法 | 转座子 | |||
磷酸钙转染 | 电转 | 逆转录病毒 (MLV) | 慢病毒 | 腺相关病毒(Rep-) | 腺病毒 | 睡美人 转座子 | |
整合几率(integration event/PFU/cell) | 10-8 | 10-6 | 10-2-10-1 | 10-2-10-1 | 10-3 | 10-6-10-4 | 10-2 |
整合位点 | 重复序 列片段 | 非核基质 -噜噗区 | 核基质区 | CpG岛; 核糖体重复序列 | 由于整合率极低,所以很少 研究 | TA位点 (染色体附近结构决定) | |
转录起始区 | 活跃表达 基因内 | 转录活跃区 表达调控区 | |||||
整合位点 转录活跃度 | 低 | 低 | 高 | 高 | 中 | 高 | |
稳定性 | 弱 | 中 | 强 | 强 | |||
拷贝数 | 多拷贝串联分布5-数百个拷贝 | 30%单拷贝 | 通过控制病毒载体用量 可以达到单拷贝 | 通过优化实验条件可以达到单拷贝 | |||
获得单拷贝细胞株的难易程度 | 难 | 中 | 易 | 易 | 易 | 易 | |
表达强度/拷贝 | 低 | 低 | 高 | 高 | 高 | 高 | |
插入失活宿主 内源基因 | 低 | 低 | 低 | 高 | 仍处于研究中 | 高 | |
插入激活宿主 内源基因 | 低 | 低 | 高 | 低 | 低 |
表七:不同病毒载体介导的基因传导的特性比较
腺病毒 载体 | 腺相关 病毒载体 | 逆转录 病毒载体 | 慢病毒载体 | 狂犬病 病毒载体 | 杆状病 毒载体 | |
表达形式 | 染色体外, 瞬时表达 | 染色体外,长期表达 | 整合 | 整合 | 整合 | 染色体外,瞬时表达 |
表达周期 | 2-4周 | 数月至数年 | >1年 | >1年 | >1年 | |
感染细 胞类型 | 分裂和 非分裂细胞 | 分裂和 非分裂细胞 | 分裂 | 分裂和 非分裂细胞 | 分裂和 非分裂细胞 | 昆虫细胞; 哺乳动物分裂细胞 |
细胞侵染 广谱性 | 广 | 对体内分化组织细胞侵染效果更好 | 广 | 广 | 高效感染脑神经细胞 | 中 |
可容纳外源片段大小 | 36kb | 4kb | 8kb | 5-8kb | ||
滴度 (TU/ml) | 1012 | 1012 | 108 | 1010 | 1012 | |
病毒制备 难易程度 | 中 | 难 | 中 | 中 | 中 | 中 |
常见应用 | 1,体外细胞基因转导 2,基因治疗 | 1,体外细胞基因转导; 2,动物模型; 3,基因治疗 | 1,体外细胞基因转导; 2,全基因组插入失活突变筛选; 3,功能细胞库构建 | 1,体外细胞基因转导; 2,基因治疗 | 1,体外细胞基因转导; 2,基因治疗 | 1,真核细胞蛋白表达(表达可溶性蛋白) |
安全性 | 高 | 高 | 中 | 高 | 中 | 高 |
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