木质部和韧皮部汁液蛋白质提取实验

2020.8.24

实验材料韧皮部汁液

试剂、试剂盒 HClNaOH丙酮甲醇DTTβ-苯巯基乙醇

仪器、耗材刀片螺旋盖试管

实验步骤

3.1 收集木质部汁液

木质部汁液属于植物细胞外空间，含有的特殊蛋白质的种类和浓度随植物的状态而变化。因为纯净的木质部汁液容易从大多数植物中得到，所以容易用蛋白质组学工具进行木质部汁液蛋白质的鉴别。准备进行单向电泳（1- DE) 或双向电泳（2- DE) 分离的蛋白质样品时，要考虑到蛋白浓度很低，且含有低聚糖（及糖基化蛋白）。用 1- DE 或 2- DE 进行木质部汁液蛋白质样品分析，有两个基本步骤，即收集木质部汁液和浓缩蛋白质。

( 1 ) 用刀片切割植物的茎，收集从根侧茎中自然流出的汁液（由于根压流出）（图 4-1)。植物的茎可以在任何髙度被切割，不过通常来讲，切割部位离茎基部越近，流出的汁液量越大。但是莲的切口要达到一定高度（大约 10 cm) 以便连接一个放在冰中的管子（见注释 1)。

( 2 ) 汁液收集。

a. 将剩下的茎段水平放置，把一根管子接在切口处。管子放在一个装有冰块的容器中，然后收集汁液达 6 h ( 图 4-1C；在汁液收集的过程中，容器冰块需补充；见注释 2 ) 。

b. 另一种方法是，渗出的木质部汁液可以每隔几分钟用移液管重复收集，液体收集到放置在冰块上的反应管里。

( 3 ) 收集汁液前要清洗切口，以除去被切细胞的细胞质和切割韧皮部时直接流出的汁液（见注释 3) 。

( 4 ) 在浓缩蛋白质前，可以用离心的方法除去颗粒状物质，像土壤颗粒、微生物细胞或残留的组织。

3.2 浓缩木质部汁液蛋白

木质部汁液不但含有蛋白质，也包含碳水化合物（见注释 4 ) 和其他化合物，如氨基酸、盐及多酚（在被病原体侵染的植株中 )。

如果进行 1-DE，简单的蛋白质沉淀就可以，甚至可以用乙醇（4 份 95% 乙醇/5% 0.1 mol/L NaAc 加入 1 份蛋白质样品中），尽管乙醇也可以沉淀多聚和低聚糖。

如果进行等电聚焦，汁液应该用 Amicon 过滤装置进行部分提纯和浓缩，之后用 TCA /丙酮进行沉淀。

1. 用 Amicon 过滤装置进行蛋白质的部分提纯和浓缩

用 Amicon CentriprepYM-3 离心超滤浓缩器（最多 15 ml，自动开关：3kDa) 和 ( 或）Amicon Centricon Plus-20 离心超滤管（更大的容积，自动开关：10kDa) 过滤装置，对木质部汁液进行浓缩及部分提纯。

( 1 ) 离心后除去微粒状物质，将最多 15 ml ( AmiconCentriprepYM- 3 ) 或者 19 ml ( Amicon Centricon Plus-20 ) 木质部汁液加入样品容器中。

( 2 ) 在 4°C、3000 g 旋转 Amicon Centriprep YM -3 75 min 直到达到平衡（过滤收集器里外液面之间）。

( 3 ) 在 4°C 旋转 Amicon Centricon Plus-20，4000 g，15 min。轻轻倒出滤液，再加入 19 ml 木质部汁液到样品过滤杯中。

( 4 ) 再旋转 15 min。

( 5 ) 轻轻倒出滤液，如果需要进一步浓缩，则重复旋转和倒出滤液的步骤。

( 6 ) 直接从 Centriprep YM-3 中收集浓缩液（至少 500 μl )。

( 7 ) 在 1000 g 旋转倒置部分（inverted unit) 5 min，从 Centricon Plus-20 收集浓缩液（至少 200 μl ) 。

2. 用 TCA / 丙酮沉淀蛋白质

( 1 ) 将 4 份 100% 丙酮溶液（含 12.5% TCA 和 0.0875% β-巯基乙醇）加入 1 份蛋白质中，并混合。

( 2 ) 在 -20°C 反应 45 min 以上（或用 80% 丙酮在 0°C 反应 1~4 h) ，然后用离心机的最快速度离心 30 min ( 不需冷冻）。

( 3 ) 弃掉上清液，并用冰冷的 100% 丙酮漂洗沉淀 3 次。

( 4 ) 除去残留液体，室温晾干沉淀。沉淀可溶于重悬缓冲液（2 mol/L 硫脲、7 mol/L 尿素、4% CHAPS、2% mmol/L DTT )[ 5 ] 后用于等电聚焦，或保存在 -20°C。

3.3 收集韧皮部汁液

韧皮部汁液比木质部汁液更难从大部分植物体中收集。因此，韧皮部汁液蛋白组学的主要难题是收集足够多的材料。不过，可根据不同植物物种的特性应用不同的采集方法。

对于一些植物物种（如蓖麻、葫芦科植物、丝兰），切小切口或割开整个植物器官 [18] 可以收集韧皮部汁液。不适宜这种收集方法的植物可以通过 EDTA 辅助分泌法 [ 19~21] 取样。许多植物都可以用蚜口针技术 [ 22 ] 得到高纯度的韧皮部汁液，但是量很少。

已经被确立的模式植物，像拟南芥或是水稻，很难采集到足够量的筛管分子渗出液用于蛋白质组研究。对于拟南芥而言，可得到的样品量不足以用于蛋白质组学的研究方法 [ 10] ，对于水稻而言，只有一些高丰度的韧皮部汁液蛋白质能够通过 planthopper 口针渗出液 [ 6，23] 被鉴别出来。大部分目前关于鉴别韧皮部多肽的信息来自于葫芦 [ 8 ] 、蓖麻 [ 10] ，最近又从油菜 [ 7 ] 得到了相关信息。

收集这些植物的韧皮部汁液要相对容易。两种版本的渗出技术（exudation technique) 描述如下所述。

1 . 版本 1

( 1 ) 用刀片切割植物的主茎或叶柄（图 4-2)。

( 2 ) 将注射针头穿刺植物体（见注释 5) 。

2 . 版本 2

( 1 ) 切割后使用地上部分一侧的断莲，用滤纸吸干切口（见注释 6 )。

( 2 ) 用滤纸吸去最先渗出的液滴。

将随后渗出的汁液吸取收集到一个保存在冰中的反应管（见注释 7)。

3.4 韧皮部汁液蛋白质的提纯

( 1 ) 在 1-DE 或 2-DE 中分离韧皮部蛋白质时，必须考虑到运输液中的高浓度糖和有机物。另外，植物对切割有御伤机制，其中包括蛋白质聚合作用 [ 24 ]。

( 2 ) 对于 1-DE 来说，韧皮部样液可以被直接加进 1-DE 样品缓冲液「25」，加热，并在室温下进行凝胶电泳。

( 3 ) 对于 2-DE，在样液用于进行等电聚焦电泳之前，蛋白质应该通过沉淀的方法提纯。