m6A修饰的YTHDF1与介导EIF3C对卵巢癌进展的影响

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m6A修饰的YTHDF1与介导EIF3C对卵巢癌进展的影响

2020.9.01

　　m6A是真核生物中最常见的一类RNA修饰，能够在多种生物过程中发挥重要作用，例如癌症发生发展、细胞分化、压力应答、免疫反应以及神经发育等。2019年m6A修饰曾创下单月发表100+篇10分影响因子的辉煌。2020年1月何川教授团队再次带领m6A登上顶级期刊Science，预示着m6A等RNA修饰将继续引领新一年的科研热点。

　　目前大部分研究主要探究m6A对蛋白编码基因的调控——即影响mRNA稳定性或翻译效率。2020年1月30日高分期刊Nucleic Acids Research上再次发表论文，证实 m6A阅读器YTHDF1能够增强EIF3C的翻译促进其表达，进而加强卵巢癌细胞整体翻译水平，促进卵巢癌的恶性进展。

　　原文链接：The m6A reader YTHDF1 promotes ovarian cancer progression via augmenting EIF3C translation

　　发表期刊：Nucleic Acids Research

　　影响因子：11.147

　　发表日期：20200130

　　运用技术：RNA-seq、MeRIP-seq、RIP-seq和RIP-qPCR等（云序提供以上服务）

　　文章内容

　　1.YTHDF1在卵巢癌中高表达

　　为了研究m6A在卵巢癌发展中的作用，作者首先使用TCGA数据集分析了m6A相关的酶在卵巢癌中的遗传变异和表达水平，其中YTHDF1基因扩增最频繁且其表达显著升高。接着，作者根据两个GEO数据集（GSE66957和GSE54388）分析了YTHDF1在卵巢癌中的表达，发现与正常卵巢上皮细胞相比，YTHDF1在卵巢癌中表达上调。

　　图1 YTHDF1在卵巢癌中高表达

　　2. YTHDF1调节卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭

　　为了探索YTHDF1在卵巢癌中的功能，作者沉默YTHDF1后检测卵巢癌细胞的表型。通过CCK8分析发现，YTHDF1的沉默显著影响了A2780和SKOV3卵巢癌细胞的生长。此外，EdU染色表明，在YTHDF1沉默后，卵巢癌细胞的增殖显著降低。同样，克隆形成实验克隆形成实验表明，敲除YTHDF1后细胞的生成能力受到抑制。此外，细胞迁移和侵袭实验表明，YTHDF1沉默会降低细胞的迁移和侵袭能力。这些结果：表明，YTHDF1在卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭中起重要作用。

　　图2 YTHDF1调节卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭

　　3. YTHDF1沉默抑制体内卵巢癌细胞的发生和转移

　　为了评估YTHDF1在体内卵巢癌中的致癌作用，作者应用了小鼠裸鼠成瘤实验进行了探究。首先，将YTHDF1缺陷型A2780卵巢癌细胞和对照细胞分别皮下注射到裸鼠中。4周后，处死小鼠并分离肿瘤。源自YTHDF1缺陷型组的肿瘤明显小于对照组。同时，与对照小鼠相比，具有YTHDF1基因敲低的小鼠的平均肿瘤体积和处死时的重量明显降低。作者还评估了这些实体瘤中的细胞增殖和凋亡指数。与对照细胞相比，YTHDF1沉默的肿瘤中Ki-67信号降低，caspase-3活性增加。注射YTHDF1沉默细胞，可大大消除细胞在腹腔内形成继发性肿瘤的能力。这些结果共同证明了YTHDF1在卵巢癌中的致癌作用是通过调节细胞增殖和转移来实现的。

　　图3 在卵巢癌中YTHDF1通过调节细胞增殖和转移致癌

　　4. 寻找YTHDF1靶基因--EIF3C

　　为了探索YTHDF1在卵巢癌发展中的潜在机制，作者分别对YTHDF1敲除和对照组的A2780细胞进行了RNA-seq（云序提供此服务）。分析结果发现了1715个差异表达的基因，包括633个上调基因和1082个下调基因。同时，作者对过表YTHDF1的A2780细胞分别进行了m6A-seq和RIP-seq（云序提供此服务）。通过m6A-seq分析，作者从3990个基因中鉴定出8104个m6A峰，这些m6A修饰主要位于mRNA中（91％），并在终止密码子附近富集。RIP-seq揭示了1698个潜在的YTHDF1候选靶基因，其中93％是mRNA。RNA-seq、m6A-seq和RIP-seq取交集后发现，与YTHDF1结合的693个基因被m6A标记，其中647个（93.4％）基因表达未发生改变。这些结果表明YTHDF1不会影响其靶基因的RNA丰度，与前人研究一致。此外，功能注释显示这647个基因参与了多个RNA代谢过程，包括翻译、mRNA剪接和RNA稳态。

　　为了全面探索YTHDF1及其靶基因之间的直接相互作用，作者对过表YTHDF1的A2780细胞，进行了eCLIP-seq，并鉴定了2,343个目标转录物，这些转录物大多数是mRNA。将eCLIP seq的结果2,343个基因和上面三组数据交集确定的647个基因取交集，产生175个基因，将其确定为YTHDF1的直接结合靶基因。接下来，作者分析了175个基因上，m6A峰和YTHDF1结合mRNA上的eCLIP峰的分布。作者发现这些转录本中的大多数YTHDF1结合位点（包括EIF3C）都与m6A位点非常吻合。GO分析表明，结合YTHDF1的转录本与翻译调控最密切相关。EIF3C是真核转录起始因子EIF3的亚基之一，其翻译控制有助于肿瘤发生。此外，EIF3C与多种癌症（包括肝细胞癌，结肠癌和乳腺癌）的恶性行为相关。CLIP-qPCR还显示YTHDF1最显著富集EIF3C mRNA。这些数据表明EIF3C是YTHDF1在卵巢癌细胞中的直接靶标。

　　图4 YTHDF1靶基因鉴定m6A测序数据展示

　　5. YTHDF1调节卵巢癌细胞中EIF3C的表达和整体蛋白合成

　　为了确认YTHDF1调节卵巢癌细胞中EIF3C的表达，作者沉默YTHDF1后，探究了EIF3C的转录和翻译水平。如预期的那样，YTHDF1沉默可降低EIF3C的蛋白质丰度，而不会影响EIF3C的mRNA水平。接着，利用RIP-qPCR（云序提供此服务）证实了YTHDF1和EIF3C mRNA之间的相互作用。然后，作者针对YTHDF1和EIF3C mRNA的结合位点设计突变（YTHDF1-mut），RIP-qPCR发现YTHDF1突变体与EIF3C mRNA之间的相互作用显著降低。蛋白质印迹分析显示，YTHDF1-wt可以增强EIF3C的表达。

　　由于EIF3C是蛋白质合成所必需的EIF3复合物的关键亚基，因此作者接下来探讨了YTHDF1是否会影响卵巢癌细胞的整体蛋白合成。为了测试这一点，作者使用HPG掺入法分析新蛋白质的合成。与对照细胞相比，EIF3C敲低后掺入到合成蛋白中的HPG在下降。同样，与对照细胞相比，YTHDF1沉默的细胞也显示HPG信号下降，这表明YTHDF1可以影响整体蛋白质合成。总的来说，这些数据表明YTHDF1通过调节卵巢癌细胞中的EIF3C蛋白表达来影响整体蛋白合成。

　　图5 YTHDF1以m6A依赖性方式调节EIF3C翻译

　　6. 回补EIF3C可改善YTHDF1沉默对卵巢癌细胞的抑癌作用

　　作者检测卵巢癌组织中EIF3C的蛋白表达，发现EIF3C在卵巢癌中的蛋白表达显著升高。

　　EIF3C敲低后，细胞生长、集落形成能力、细胞迁移和侵袭均受到明显抑制。这些结果表明，EIF3C促进了卵巢癌的肿瘤发生。接着，作者在沉默YTHDF1的A2780和SKOV3细胞中过表达EIF3C，YTHDF1沉默会抑制细胞生长、集落形成、细胞迁移和侵袭，而EIF3C的回补则可以逆转这种抑制作用。这些结果表明，EIF3C是YTHDF1促进卵巢癌进展的关键下游靶标。最后，作者分析了卵巢癌组织中EIF3C蛋白表达与YTHDF1蛋白表达之间的相关性，发现YTHDF1的蛋白质丰度与EIF3C的表达呈正相关。以上结果显示，YTHDF1表达增加可以调节EIF3C翻译进而增强整体蛋白质合成，并促进卵巢癌细胞的肿瘤发生。

　　图6 YTHDF1依赖EIF3C促进卵巢癌细胞的生长和迁移

　　总结：

　　M6A甲基化是哺乳动物mRNA中含量最丰富的RNA修饰，越来越多的证据表明m6A在人类肿瘤发生中起着关键作用。本文，作者利用RNA-seq、MeRIP-seq和RIP-seq等多种技术联合分析，发现甲基化识别蛋白YTHDF1的直接靶点--蛋白质翻译起始因子eIF3的一个亚基EIF3C。YTHDF1通过与m6A修饰的EIF3C mRNA结合，以m6A依赖的方式增加EIF3C的翻译，同时促进整体蛋白合成，从而促进卵巢癌的发生和转移。本文确定了对卵巢癌进展至关重要的新的YTHDF1-EIF3C轴，为开发癌症治疗提供新的靶点。

　　图7 YTHDF1介导的EIF3C翻译在卵巢癌中的作用

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　　云序生物作为国内最早做m6A的科研平台，至今用户已发表10多篇m6A相关文章，其中多篇影响因子超过10分。云序生物RNA修饰高通量测序产品覆盖面广，包括编码mRNA和非编码lncRNA，circRNA，microRNA等分子。云序生物既提供针对单个分子的m6A测序，也提供一次检测多种RNA分子m6A修饰的全转录组测序，此外公司长期致力于提供优质前沿表观研究测序产品，结合最新科研热点继m6A、m5C、m1A之后，隆重推出多款RNA新修饰，不仅有m7G测序，还包括m3C测序、ac4C乙酰化测序和2'-O-甲基化测序，打造了全修饰和全分子覆盖的研究平台。

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　　利用m6A特异性抗体，通过免疫共沉淀技术（MeRIP方法）特异性富集发生甲基化修饰的RNA，与不处理组（Input）做对比，对m6A修饰进行高通量测序和peak峰定位。

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周锦帆