覆盆子及有效部位对老年大鼠学习记忆能力的影响及机制
目的: 考察覆盆子有效部位对自然衰老大鼠学习记忆能力的影响。
方法: 18 月龄大的自然衰老大鼠分为老年组、银杏黄酮阳性组、覆盆子乙酸乙酯部位组、覆盆子氯仿部位组、覆盆子全药材组，另取 3 月龄的大鼠为青年对照组。覆盆子乙酸乙酯组、氯仿组、全药组分别灌胃给予相应提取物 12g / kg，阳性药物组给予银杏黄酮 5． 785mg / kg，老年组和青年组分别灌胃等容量生理盐水，连续 30d。检测大鼠在 Morris 水迷宫中的定位航行能力、空间探索能力，并检测大鼠脑组织中乙酰胆碱酯酶、乙酰胆碱转移 酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性、总超氧岐化酶活性、过氧化氢酶活性及丙二醛含量。结果: 覆盆子乙酸乙酯组、覆盆子氯仿组、覆盆 子全药组均可不同程度缩短大鼠的逃避潜伏期，明显增加穿越平台次数； 覆盆子乙酸乙酯组、覆盆子氯仿组、覆盆子全药组、银杏黄 酮阳性组可明显提高老年大鼠脑组织中的乙酰胆碱转移酶活性，同时覆盆子乙酸乙酯组、覆盆子氯仿组、银杏黄酮阳性组降低乙酰 胆碱酯酶活性； 覆盆子乙酸乙酯组、覆盆子氯仿组、覆盆子全药组、银杏黄酮阳性组可明显升高老年大鼠脑组织总超氧岐化酶、过氧 化氢酶活性，明显降低丙二醛含量； 覆盆子乙酸乙酯组、覆盆子氯仿组、银杏黄酮阳性组可明显升高谷胱甘肽过氧化物酶酶活性。
结论: 覆盆子乙酸乙酯部位能提高自然衰老大鼠的学习记忆能力，因为其提高老年大鼠脑部胆碱能功能和减少脑部自由基损伤最 为明显，其次是氯仿部位，最后是全药部位。
关键词 覆盆子萃取部位； 学习记忆； Morris 水迷宫； 衰老
现代药理研究发现，覆盆子作用广泛，除延缓衰老外、还有对生殖系统的调节作用、抗氧化作用等。我们前期发现覆盆子氯仿提取部位和乙酸乙酯提取部位对 D-半乳糖联合氢化可的松造成的肾阳虚型痴呆大鼠和东莨菪碱所致的学习记忆障碍
大鼠有很明显的改善其学习记忆的作用［1，2］，但对自然衰老大鼠学习记忆功能的影响尚无文献报道。故本研究以自然衰老的大鼠为研究对象，观察覆盆子各有效部位对大鼠学习记忆能力以及脑组织中与学习记忆和衰老相关的酶及衰老相关代谢产物的影响，从而进一步研究覆盆子改善学习记忆的机制与物质基础。
1.材料与方法
1．1 试验药物 覆盆子购于江西省樟树药材市场，由江西中医药大学中药资源学科组刘庆华老师鉴定为蔷薇科悬钩子属值物掌叶覆盆子 Ｒubus chingii Hu 的未成熟果。经鉴定该药材质 量符合 2010 版中国药典要求。取覆盆子药材粉末 80% 乙醇渗 漉，回收乙醇得浸膏。浸膏用水混悬，依次用氯仿、乙酸乙酯萃 取，得到覆盆子全药、氯仿、乙酸乙酯共三个部位，由江西中医药 大学药物分析室谢一辉教授制备，-20℃ 保存，临用前稀释至覆 盆子全药
1．2g 生药 / ml、乙酸乙酯部位 1． 2g 生药 / ml、氯仿部位
1．2g 生药 / ml ； 阳性药银杏叶片，深圳海王药业有限公司，批号:20121004。
1． 2 动物 18 月龄 SD 大鼠，SPF 级，50 只，雌雄各半，体质重 ( 500 ± 20) g； 3 月龄 SD 青年大鼠，SPF 级，10 只，雌雄各半，体质 重( 220 ± 20) g。均由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供， 许可证为: SCXK( 湘) 2009-0004。
1．3 试剂 乙酰胆碱酯酶试剂盒，批号: 20140122，乙酰胆碱 转移酶试剂盒，批号: 20140119，谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒，批 号: 20130927，总超氧岐化酶试剂盒，批号: 20130926，过氧化氢酶试剂盒，批号: 20131012，丙二醛试剂盒，批号: 20130927，均购自南京建成试剂有限公司。
1．4 仪器 Morris 水迷宫，北京众实迪创科技发展有限责任公司； 万分之一分析天平，Sartorius，德国； -80℃ 冰箱，Thermo，美国。
1.5 方法 大鼠进行随机分成 5 组，分别为老年组、银杏黄酮 阳性组、覆盆子乙酸乙酯组、氯仿组、全药组，另设青年组( 为 3个月龄的 SD 大鼠) 。青年组和老年组灌胃生理盐水 1m1 /100g，乙酸乙酯组、氯仿组、全药组分别灌胃给予覆盆子相应萃取部12g 生药 / kg，银杏黄酮阳性组给予银杏黄酮 5． 785mg / kg，给药 容量 1m1 /100g，连续 1 个月。
1．5．1 定位航行试验 共 5 天，面向池壁将大鼠分别从三个不 同象限的入水点放入水中，记录其在 60 秒内寻找到平台所用的 时间，此是逃避潜伏期( escape latency) 。大鼠如果 60 秒内找不 到平台则由实验操作者牵引实验大鼠停留在平台上 10 ～ 15s，参与文献［4］进行。
1．5．2 空间探索试验 实验第 6 天，撤除平台，任意选择 1 个
入水点将大鼠放入水中，记录其 60 秒内: 动物穿越虚拟平台的 次数； 空间探索试验中在原平台所在象限活动时间和动物在目 标象限( 原平台所在象限) 游泳路程。
1.5．3 乙酰胆碱酯酶、乙酰胆碱转移酶活性检测 水迷宫实验 结束后，取脑组织，进行组织匀浆，制成 10% 的匀浆液，检测乙 酰胆碱酯酶、乙酰胆碱转移酶活性，具体方法按试剂盒说明书进行。
1．5．4 总超氧岐化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活性 及丙二醛含量检测 取脑组织 10% 的匀浆液进行 总超氧岐化 酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活性及丙二醛含量检测， 具体方法按试剂盒说明书进行。
1.结果
2．1 覆盆子各提取部位大鼠学习记忆的影响 ( Morris 水迷宫 法) 在水迷宫实验中: 与青年组比较，老年组大鼠逃避潜伏期 明显延长，穿越平台次数明显减少，提示老年组大鼠学习记忆 功能降低； 与老年组大鼠比较，乙酸乙酯组、氯仿组、全药组、银杏黄酮阳性组大鼠逃避潜伏期明显缩短，穿越平台次数明显增加。而各给药组中覆盆子乙酸乙酯组对大鼠逃避潜伏期有更显著的缩短，且穿越平台次数增加更明显，结果见表 1、2。
表 1 覆盆子不同萃取部位对自然衰老大鼠逃避潜伏期的影响 ( x珋± s，秒)
组别
鼠数
剂量
第一天
第二天
第三天
第四天
第五天
( 只)
( g 生药 / kg)
( s)
( s)
( s)
( s)
( s)
青年对照
10
43． 12 ± 16． 56＊＊ 25． 23 ± 14．
89＊＊
17． 68 ± 14．
16＊＊
13． 41 ± 6． 00＊＊
10． 87 ± 4． 88＊＊
老年对照
10
59． 51 ± 1． 58
59． 21 ± 2． 52
55． 76 ± 9． 05
56． 92 ± 6． 64
56． 72 ± 7． 14
银杏黄酮
10
0． 0058
43． 43 ± 18． 64
41． 84
± 19．
25*
40． 53
± 21．
25
32． 58 ± 17． 27＊＊
22． 04
± 16． 0＊＊
覆盆子乙酸乙酯
10
12
49． 53 ± 16． 67
43． 17
± 18．
08*
38． 14
± 14．
59*
29． 29 ± 17． 84＊＊
19． 21
± 11． 67＊＊
覆盆子氯仿
10
12
48． 86 ± 18． 00
45． 28
± 19．
48
36． 23
± 20．
76*
30． 47 ± 18． 04＊＊
23． 03
± 15． 42＊＊
覆盆子全药
10
12
49． 33 ± 17． 51
46． 14
± 18．
17
37． 91
± 16．
70*
30． 53 ± 16． 81＊＊
27． 42
± 21． 39＊＊
与老年组比较 *
P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 01( 下同)
表 2 覆盆子不同萃取部位对自然衰老大鼠空间探索的影响 ( x珋± s，n = 10)
组别
剂量
第一象限停留
第一象限游动
穿越平台
( g 生药 / kg)
时间( s)
距离( mm)
次数( 次)
青年对照
19． 76 ± 4．
72＊＊ 233．
83
± 41． 19*
2．
91
± 0． 87＊＊
老年对照
13． 21 ± 5．
51
159．
44
± 31． 28
0．
33
± 0． 48
银杏黄酮
0．
0058
16． 42
± 3．
91*
214．
17
± 32． 83＊＊ 2．
38
± 1． 26＊＊
覆盆子乙酸乙酯
12
15． 32
± 5．
65
174．
39
± 38． 29＊＊ 2．
58
± 0． 97＊＊
覆盆子氯仿
12
16． 79
± 4．
61*
188．
63
± 31． 57＊＊ 2．
21
± 1． 03＊＊
覆盆子全药
12
17． 81
± 3．
97*
209．
65
± 34． 21*
2．
04
± 0． 94＊＊
2． 1． 2
覆盆子各提取部位对大鼠胆碱能神经递质的影响
结果见表 3。与青年组相比老年组大鼠脑组织乙酰胆碱转移酶活 性明显下降，而乙酰胆碱酯酶活性明显升高。与老年组相比，覆 盆子乙酸乙酯部位、氯仿部位及阳性药可明显升高老龄鼠脑组 织乙酰胆碱转移酶活性，同时降低乙酰胆碱酯酶活性。酶活性、过氧化氢酶活性、丙二醛含量均具有极显著性差异，提 示自然衰老的老龄鼠脑部可能存在自由基损伤过度，氧化代谢 产生过多，从而引起学习记忆功能的下降。与老年组比较，银杏 黄酮阳性组大鼠的脑组织中谷胱甘肽过氧化物酶酶活性、过氧 化氢酶活性显著性升高，总超氧岐化酶含量极显著性升高，丙二 醛含量明显减少； 覆盆子乙酸乙酯组大鼠脑组织中谷胱甘肽过 氧化物酶酶活性、总超氧岐化酶含量、过氧化氢酶活性均显著性 升高，丙二醛含量极显著性降低； 覆盆子氯仿组大鼠的脑组织中 谷胱甘肽过氧化物酶酶活性、总超氧岐化酶活性、过氧化氢酶活 性均显著性升高，丙二醛含量极显著性降低； 覆盆子全药组大鼠 的脑组织中总超氧岐化酶活性、过氧化氢酶活性均显著性升高， 丙二醛含量极显著性降低，而谷胱甘肽过氧化物酶酶的活性未 见明显差异。
表 3 覆盆子不同萃取部位对自然衰老大鼠脑组织乙酰胆碱转移 酶、乙酰胆碱酯酶活性的影响 ( x珋± s，n = 10)
组别
剂量
乙酰胆碱转移
乙酰胆碱酯
( g 生药 / kg)
酶活性( IU / g)
酶活性( U / mgprot)
青年对照
67． 62 ± 11．
17＊＊
0． 33 ± 0．
04＊＊
老年对照
28． 79 ± 11．
66
0． 49 ± 0．
05
银杏黄酮
0． 0058
51． 37
± 10．
59＊＊
0． 39
± 0．
04＊＊
覆盆子乙酸乙酯
12
46． 98
± 7． 20＊＊
0． 39
± 0．
05＊＊
覆盆子氯仿
12
44． 72
± 9． 24＊＊
0． 44
± 0．
05*
覆盆子全药
12
37． 52
± 5． 49*
0． 46
± 0．
05
2． 2 对老化相关酶及相关代谢产物的影响
与青年组比较，老
年组大鼠的脑组织中谷胱甘肽过氧化物酶酶活性、总超氧岐化
表 4 覆盆子不同萃取部位对自然衰老大鼠大脑的影响 ( x珋± s，n =10)
剂量
谷胱甘肽过氧
总超氧
过氧化氢
丙二醛含量
组别
化物酶酶活性
岐化酶含量
酶活性
( 生药 g / kg)
( nmol / mg prot)
( U / mg prot)
( U / mg prot)
(
U / mg prot)
青年对照
45． 88 ± 5．
45＊＊
6． 80 ± 0．
39＊＊
3．
90
± 0． 32＊＊
2． 01 ± 0．
54＊＊
老年对照
39． 66 ± 1．
16
5． 40 ± 0．
30
3．
03
± 0． 39
7． 36 ± 2．
23
银杏黄酮
0． 0058
44． 50
± 3．
84*
5． 83
± 0．
30＊＊
3．
62
± 0． 21*
4． 02
± 1．
63*
覆盆子乙酸乙酯
12
43． 01
± 2．
77*
5． 95
± 0．
38＊＊
3．
36
± 0． 13*
2． 12
± 0．
79＊＊
覆盆子氯仿
12
42． 01
± 2．
78*
5． 88
± 0．
32*
3．
30
± 0． 22*
2． 29
± 0．
49＊＊
覆盆子全药
12
41． 80
± 2．
39
5． 72
± 0．
71*
3．
24
± 0． 17*
2． 14
± 0．
36＊＊
112 中药药理与临床 2015； 31( 3)
1.讨论
学习记忆在认知活动中具有重要作用，同时也是智力结构 中的重要组成要素。学习记忆功能体现出脑的高级整合功能，其功能的减退、丧失是脑衰老的重要标志。Morris 圆形水迷宫 主要用于测试动物( 大、小鼠) 对空间位置觉和方位觉的学习记 忆能力，本实验通过 Morris 水迷宫结果显示与青年组比较，老年 组大鼠逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数明显减少，提示老 年组大鼠学习记忆功能降低。与老年组大鼠比较给药组大鼠 尤其是乙酸乙酯组大鼠逃避潜伏期明显缩短，穿越平台面次数 明显增加，提示覆盆子各部位有改善老年大鼠学习记忆的作 用，且乙酸乙酯部位改善作用最为明显，其次是氯仿部位，最后 是全药部位。
乙酰胆碱是中枢胆碱能神经的重要递质。它由胆碱乙酰 转移酶( 乙酰胆碱转移酶) 合成、乙酰胆碱酯酶( 乙酰胆碱酯酶) 分解，通过乙酰胆碱受体发挥生物学效应。乙酰胆碱平衡由乙 酰胆碱转移酶和乙酰胆碱酯酶共同维持。生物体随着年龄增 长，胆碱能系统功能随之逐渐衰退，表现为代谢失调、受体的数 目和亲和力的变化，导致中枢神经生理异常。研究发现增加大 鼠海马乙酰胆碱转移酶的活性，可提高大鼠空间学习的能力 。实验通过检测乙酰胆碱转移酶、乙酰胆碱酯酶 结果显 示青年组相比，老年组大鼠脑组织乙酰胆碱转移酶活力明显下 降，而乙酰胆碱酯酶活性明显升高，提示老年组大鼠与学习记 忆有关的胆碱能神经递质乙酰胆碱生成来源减少且水解去路 增加，胆碱能功能下降。与老年组相比，覆盆子乙酸乙酯部位、 氯仿部位及阳性药可明显升高老龄鼠脑组织乙酰胆碱转移酶 活性，同时降低乙酰胆碱酯酶活性，但是全药仅升高老龄鼠脑 组织乙酰胆碱转移酶活性，对乙酰胆碱酯酶活性无显著影响。 同时覆盆子乙酸乙酯部位比氯仿部位改善作用更明显，提示覆 盆子乙酸乙酯部位可更显著的增加与学习记忆有关的胆碱能 神经递质乙酰胆碱的含量，提高胆碱能功能而达改善学习记忆 的作用，保护由衰老导致的机体脑组织功能降低。
老年鼠海马中自由基和兴奋性氨基酸相互作用，导致海马 神经死亡.由于海马是动物学习、记的重要神经解剖学结构故导致学习记忆能力下降 。自由基又称游离基 是未配对电子的原子和原子团，它具有高度活泼的化学特性，会与相邻物质发生电子的得失交换，造成组织损伤。像氨基酸这种生物大分子易遭受自由基攻击。正常情况下，机体的自由基含量会很 低，并且会迅速被酶破坏。但是随着年龄的增长，酶活性会降低 以及机体物质代谢会发生变化，这必然导致自由基产生过多。 海马中自由基攻击兴奋性氨基酸，引起海马神经死亡，从而导 致老年鼠的学习记忆能力下降。实验通过检测老龄鼠脑组织 谷胱甘肽过氧化物酶活性、总超氧岐化酶活性、过氧化氢酶活 性以及丙二醛含量变化来阐明覆盆子对老龄鼠学习记忆的影 响。本次试验结果表明，老年组较青年组，脑组织中与衰老相关 的酶谷胱甘肽过氧化物酶、总超氧岐化酶、过氧化氢酶的活性 均明显降低，而与衰老相关的代谢产物丙二醛含量显著升高， 表明自然衰老的大鼠作为此次试验的模型是可取的。各给药 组与老年组比较，脑组织中与衰老相关的酶谷胱甘肽过氧化物酶、总超氧岐化酶、过氧化氢酶活性在一定程度上升高，而与衰老相关的代谢产物丙二醛含量也呈下降趋势，这表明覆盆子可通过影响老龄鼠脑组织自由基的变化来改善学习记忆。且覆盆子乙酸乙酯部位改善最为明显，氯仿部位其次，最后是全药部位。
以上结果提示覆盆子乙酸乙酯部位、氯仿部位以及全药均有一定的改善自然衰老大鼠的学习记忆能力。但是从老年鼠水迷宫的行为学实验数据以及乙酰胆碱酯酶、乙酰胆碱转移酶、老化相关酶及相关代谢产物的生化指标数据上观察，覆盆子的乙酸乙酯部位改善作用最为明显，氯仿部位改善作用其次，全药部位改善作用最弱。然而学习记忆的机制比较复杂，通路较多，覆盆子其影响学习记忆的具体机制与作用通路仍值得深入研究。
这些有效部位中具体起作用的成分还有待进一步探讨。
来源：北京众实迪创科技发展有限责任公司
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