肽段标记物的序列簇来源于高丰度的血浆多肽和蛋白质前体

　　三个序列簇来源于天然产生的血浆多肽纤维蛋白肽A (FPA)、补体C3f和缓激肽，这些肽段分别产生自或是体内内源性途径早期血浆蛋白的胞外蛋白降解过程（缓激肽产生于高分子量激肽原被激肽释放酶降解的过程中），或产生于血浆制备过程中（纤维蛋白素原N末端被凝血酶裂解而产生FPA；C3转变为C3b后经因子I 和 H作用而释放C3f）^[37,38]。全长的建立者肽（founder peptides）末端为Arg 或 Lys，之后是一个疏水的氨基酸如Val, Leu, 或Phe。C3f和缓激肽去掉了Arg而形成去Arg-缓激肽。其它肽段簇也由类似的胰酶样降解作用而形成（见后文）。39个酶切位点中，21个是C末端碱性氨基酸之前存在一个疏水氨基酸(F、L、V、 I、W或A)，15个为S、Q或N（见补充表4）。典型情况是，Arg/Lys全部或部分被羧肽酶降解掉，除非之前有一个Pro（3/3）或者有时是Val（2/4）。此后C端或N端才进行进一步的胞外降解作用直至完全降解或中途停顿，产生许多或者各式中间产物（见图5及补充表3），此过程周而复始，在各个簇中重复发生（见后文）。

　　诊断性的MALDI-TOF质谱模式中包括N末端FPA和C3f降解物，此前在心肌梗塞患者的血清中曾经报告存在这两种多肽^[30]。而与此相反，我们在对照血清中共检测出19种多肽，在癌症患者血清中，这些多肽有的持续保持很低水平（如各种癌症患者中所有的FPA片段和乳腺癌患者中 3C3f片段），有的则呈高水平（如膀胱癌和前列腺癌中的几种C3f片段和乳腺癌中的一种FPA片段）。全长C3f在各样本中均为较高水平且接近，而膀胱癌患者血清中几乎见不到全长FPA。这些样本中均未检出纤维蛋白B及其片段。与以往报告的卵巢癌患者血清磷酸FPA水平升高（电喷射离子化MS法，[31])和胃肠道癌症及乳腺癌患者FPA水平升高（免疫化学法检测，^[39,40]）不同，我们的结果显示，前列腺癌、膀胱癌和乳腺癌患者血清中FPA水平降低。

　　图8. 研究总览。简图中显示了用于开发及验证68个肽离子和前列腺癌的26个序列已知的特征性血清肽（图5，蓝色)的方法。画圈的数字表示在研究各阶段选定肽段的总数目。

　　缓激肽被认为是一种癌症生长因子，研究人员曾对其各种拮抗剂的抗癌作用进行过测试^[41]。我们则发现，乳腺癌患者血清中缓激肽和去Arg-缓激肽的水平均升高，而膀胱癌患者中却是降低的（见图5）。各种多肽的羟基化形式(42)prohydroxylated forms 也呈类似趋势（结果未显示）。缓激肽及FPA的来源，蛋白纤维蛋白素原?和HMW-激肽原，各自形成一种序列簇，成为癌症的特征性多肽，其位置与前体序列不同（见图5，图7和补充表3、4）。有趣的是，缓激肽与其他激肽原来源的多肽具有相反的标记特性。例如，膀胱癌中缓激肽和去Arg-缓激肽的离子强度较正常组降低，而其他肽段(如1944 和 2209)则相对升高（见图5、6）。以往常有草率的解释，认为某些肽段的离子强度相对于正常人偏高或偏低是由于原始蛋白上调或下调所致，本文的观察结果直接反驳了这一论点，很显然，HMW-缓激肽的水平不可能同时既上调又下调。

　　多肽2724（见图5）是来自交联-α-胰蛋白酶抑制物重链(ITIH4)前体[43]包括第662–687位氨基酸(补充表3、4），由于含两个激肽释放酶酶切位点(Phe-Arg–Xaa)而得名。第662–687位氨基酸残基似乎是一种功能未知的前肽[44]，与缓激肽相似，末端也是Pro-Phe-Arg。几个较长的ITIH4前体片段，包括3272（第658–687位氨基酸），横跨第一个激肽释放酶酶切位点，是早期卵巢癌的生物标记物[32]。进一步研究表明，仅仅改变ITIH4簇N末端的几个氨基酸即可产生对于不同癌症具有选择性的离子标记。例如肽段3971和3273的离子强度中位数在膀胱癌中水平最高，而肽段2358 和 2184在乳腺癌中最高，前列腺癌中肽段2271水平最高。肽段2115与ITIH4的一种剪接异构体序列匹配(PRO1851; 见补充表4)，似乎对各种癌症都具有标记作用，特别是膀胱癌和乳腺癌（见图6）。

　　另一个簇包括2×4个肽段，位于Ile-Arg—Xaa酶切位点的一侧，来源于补体C4a前体^[45]（见图5和补充表3、4）。此C4a簇在乳腺癌中作为离子标记物的发生率最高，超过所有其他簇，也超过C4a来源的膀胱癌标记物（表6）。此簇中仅有一个离子（肽段1763)是前列腺癌的标记物，同时也是其他两种癌症的标记物。另外，源自apoA-I、apoA-IV和apoE的离子标记物除1个外、均具有膀胱癌特异性，且离子强度均较高；肽段1971例外，是乳腺癌中最为显著(P = 5.5×10–13)的离子标记物。

　　图9. 用于验证多肽特征性生物标记物的独立前列腺癌血清样本。(A) 实验设计见图8及结果部分。(B)对PR1、 PR2和对照组的分级聚类分析。采用了3个二元比较中具有统计学显著性的68个肽离子和组成前列腺癌特征性的26个序列已知的肽段，其余的近650个肽离子未予处理。标准化离子强度的热图比例范围为从0（绿色）到2000（红色），中点为1000（黄色）。(C) PR1和PR2组与对照组的主成分分析，肽离子同B。图中显示了造成原始数据差异的前3个主要成分。

表1. 采用SVM法分析651个特征肽段, 68个特征肽段和26个特征肽段对一个前列腺癌效验组进行分级预测

　　预测正确的百分率列于表中。41例患者中，40个预测正确，双侧95%可信区间为87.1–99.9%； 41个预测正确的区间为91.4–100%。训练组为PR1与对照组（二元）或3个癌症组与对照组（多级）。
m/z bin：已鉴定的m/z 值 (多次质量测定) (见补充方法)。

　　免疫组化研究证实，丛生蛋白（如apoJ)上调与前列腺癌和膀胱癌都相关^[46-48]。我们检测到前列腺癌和膀胱癌患者血清中长度为10个氨基酸的丛生蛋白片断（位于C末端）的浓度升高（补充表2、3）。切断Val-Arg–Xaa键分离丛生蛋白(N-t)和(C-t)后，一次单酶切足以释放此肽段。因此，一个长度为6个氨基酸的亚片断作为膀胱癌标记物更为显著（表5、6），这与其他大多数来自apoA-I, apoA-IV和apoE的肽段变化趋势相同。

　　最后，两个离子（肽段2602和2451)与XIIIa因子和transthyretin来源的肽段相应（图5、6），在乳腺癌中的强度高于正常人。肽段2602对应于XIIIa因子前肽（37个氨基酸）的C端25个氨基酸（补充表3、4）。有趣的是，乳腺癌中XIIIa因子自身是下调的^[49]。尽管我们尚不清楚在本研究中患者血样是否具有同样的变化，但是进一步反驳了离子强度升高是由于前体物上调所造成的这一论点。