酶联免疫吸附测定黄曲霉毒素B1
(1)分析原理
将已知抗原吸附在固态载体表面,洗除未吸附抗原,加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液,竞争培养后,在固相载体表面形成抗原抗体复合物。洗除多余抗体成分,然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物,与吸附在固体表面的抗原抗体复合物相结合,再加入酶的底物。在酶的催化作用下,底物发生降解反应,产生有色物质,通过酶标检测仪测出酶底物的降解量,从而推知被测样品中的抗原量。
(2)试剂与仪器
四甲基联苯胺(TMB),30%过氧化氢,牛血清白蛋白,吐温-20等抗体:抗黄曲霉毒素B1 的特异性单克隆抗体(或抗血清)。
包被抗原:黄曲霉毒素 B1 与载体蛋白(牛血清白蛋白或多聚赖氨酸等)的结合物。
酶标二抗:羊抗鼠免疫球蛋白 G 与辣根过氧化酶结合物。
缓冲液系统:包被缓冲液为 PH9.6的磷酸盐缓冲液;洗液为含0.05%吐温-20的PH7.4的磷酸盐缓冲液;底物缓冲液为 PH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液;终止液为1mol/L的硫酸。
黄曲霉毒素 B1 的标准溶液:用甲醇配成1mg/mL 的黄曲霉毒素 B1 贮备液,-20℃冰箱贮存,于检测当天,准确吸取贮备液,用20%甲醇的 PBS 稀释成制备标准曲线的所需浓度。
(3)测定步骤
①提取:称取10g 粉碎的样品于锥形瓶中,用50mL 乙腈-水(50+50,V/V),用2mol/L碳酸盐缓冲液调 pH 值至8.0进行提取,振摇30min 后,滤纸过滤,滤液用含0.1%BSA的洗液稀释后,供 ELISA 检测之用。
②用包被抗原(包被缓冲液稀释至10μg/mL)包被酶标微孔板,每孔100μL。4℃过夜。
③酶标微孔板用洗液洗3次,每次3min 后,每孔加50μL 系列标准黄曲霉毒素 B1 溶液(制作标准曲线)或50L 样品提取液(检测样品),然后再加入50μL 稀释抗体,37℃培养1.5h。
④酶标微孔板用洗液洗3次,每次3min 后,每孔加100μL 酶标二抗。37℃培养2h。
⑤酶标微孔板用上法洗后,每孔加100μL底物溶液(配制方法:10mg 四甲基联苯胺溶于1mL 二甲基甲酰胺中,取7L 四甲基联苯胺溶液,加入10mL 底物缓冲液,加10μL 30%过氧化氢溶液),37℃培养30min 后,用1mol/L 硫酸中止反应。
⑥计算:
黄曲霉毒素 B1 浓度(ng/g)=C×V1/V2×D×1/m
式中C——酶标微孔板上所测得的黄曲霉毒素 B1 的量,ng,根据标准曲线求得;
V1——样品提取液的体积,mL;
V2——滴加样液的体积,mL;
D——样液的总稀释倍数;
m——样品质量,g。
检测灵敏度:0.1～1ng/mL。
