农药残留检测技术--试剂盒的应用

　　免疫检测试剂盒的应用

　　 目前国外已研制出几十种农药的酶免疫检测试剂盒，包括有机磷类、氨基甲酸、硫代氨基甲酸酯类、有机氯类、三嗪类、拟除虫菊酯类及酰胺类等。美国使用的 ELISA试剂盒对有机磷农药普遍的最小检出浓度达20μg/kg，对氨基甲酸酯类农药普遍的最小检出浓度达300μg/kg。免疫检测试剂盒使用起来简便、快速，操作人员不需经过特殊培训，样品不需净化或只需简单的净化。

　　 现以国产对硫磷农药酶联免疫抗体制备及ELISA方法为例做一介绍。

　　 （1）对硫磷（1605）农药的酶联免疫分析 对硫磷与其他的有机磷农药一样，都属于小分子物质，必须与大分子物质（如蛋白质）联结，才能用作免疫原。农药的抗体制备和免疫分析方法与其他小分子物质类似，读者可以查阅到很多相关资料。

　　 ①免疫抗原的合成 对硫磷先在浓盐酸和金属还原剂（Zn/Fe）的作用下将苯环上一硝基还原成氨基，经过重氮化后与牛血清白蛋白（BSA）联结。纯化联结物，在紫外可见分光光度计上扫描以鉴定半抗原的联结情况。

　　 ②包被抗原的合成 方法与免疫抗原的制备方法基本相同，只是把载体蛋白BSA改为卵清白蛋白（OVA）。

　　 ③抗体的制备与纯化

　　 a.免疫动物 初次免疫，用一定量的免疫抗原与等量的完全弗氏佐剂混合乳化，大腿肌肉注射3～4只体重1.5kg左右的白兔。以后每隔2周进行一次加强免疫，加强免疫用不完全弗氏佐剂，皮下注射。从第二次加强免疫开始，每次免疫后约10天从耳静脉采少量血液，以监测抗体效价。

　　 b.抗体效价的验证第5次加强免疫后，抗体效价即可达到所要求的水平。颈动脉采全血，离心、分装、冻存。用PBS缓冲液10倍稀释，以包被抗原包被酶标板，用ELISA法检测抗血清效价。

　　 c.抗体纯化抗血清先用50％饱和硫酸铵沉淀再用DEAE-52分离IgG。

　　 ④免疫测定条件的筛选及标准曲线的建立

　　 a.包被:将包被抗原按照一定的稀释倍数稀释，100微升/孔加到酶标板上，在37℃或4℃下包被一定时间。

　　 b.洗板:洗板四次，第一次迅速倒掉，以后每次放置约1min再倒掉，洗完后在吸水纸上将板甩干。

　　 c.竞争:加标样或样品50微升/孔，加抗体50微升/孔。

　　 d.洗板:同上操作。

　　 e.加酶标二抗（IgG-HRP）:IgG-HRP按一定倍数稀释，100微升/孔加入酶标板。温育条件为37℃、30min。

　　 f.洗板:洗板五次，方法同上。

　　 g.显色:加100微升/孔显色液，底物现配现用，当最大浓度孔与0孔之间OD值相差最大时终止显色。

　　 h.终止:用3mol/LH2SO4终止，50微升/孔。

　　 按照以上步骤，用方阵法筛选最佳温育时间、温度及包被抗原、抗体浓度，建立标准曲线，确定最小检测极限以及抗体与其他有机磷农药的交差反应。

　　 ⑤样品测定与验证 称取1g白菜样品三份，分别添加250ng，500ng，1000ng的对硫磷标样，用5ml甲醇磨样提取过夜，400r/min离心。取上清液，一半用于GLC测定，一半用氮气吹干，再用0.5mL样品缓冲液定容，ELISA测定。

　　 ⑥实验结果对硫磷抗体 ELISA效价为1:8000倍，标准曲线方程为Y＝-1.32X＋7.14，相关系数为0.9733，其最小检测限为62.5ng/mL.当标样中的浓度分别为250ng，500ng，1000ng时，ELISA测定的回收率分别为88.4％，90.2％，93.5％，GLC测定的回收率分别为94.0％，96.8％，95.8％，说明 ELISA测定结果是可靠的。对硫磷抗体与甲基对硫磷、甲胺磷、马拉硫磷、久效磷和氧乐果五种常用有机磷农药的交差反应值都很小（＜1％）。

　　 用上述方法制备的对硫磷抗体免疫效价和检测极限并不高，这主要是由于所采用的免疫抗原制备方法的限制。如果在载体蛋白与对硫磷半抗原之间加一连接桥，可能获得效价高的抗体，且提高检测极限。