冷冻蚀刻电镜技术操作方法
操作方法
冷冻蚀刻的操作方法按以下步骤进行。
1.预处理取新鲜组织块，大小为15~3~5mm，用25%戊二醛固定1~3小时。为防止冰晶形成，用30%甘油生理盐水浸泡8~12小时。
2.冷冻断裂是在冷冻条件下使样品变得又硬又脆，用刀劈裂样品，暴露观察面。因为是用刀劈裂的样品，断裂往往发生在细胞被冻结后较脆弱的部位，多数是沿细胞及细胞器的膜裂开。由于断裂面是凸凹不平的，所以图像立体感强。冷冻断裂时，刀的作用在于劈裂，而不是切割，所以刀刃不必锋利，但不能有缺口、油污和水份，还需保持清洁干燥。冷冻复型的断裂操作要在真空中进行，是因为真空对热传导性差，能使样品较长时间维持在较恒定温度下进行断裂操作，同时也便于进行下步的蚀刻处理。仪器中进行断裂的最佳条件:真空度为133×10-5~3×40-3Pa(1×10-5~3×10-5Torr)，样品升温至-100℃~-110℃。
3.蚀刻就是在真空中使冷冻样品表面上的冰升华。目的是为了暴露出样品断裂面上的超微结构，便于喷镀。一般认为最佳蚀刻深度约为30nm。若蚀刻深度不够，结构被冰掩盖不能充分暴露出来，图像模糊;若蚀刻深度过大，超微结构因其基础支持不足而倒塌，从而破坏了超微结构。蚀刻深度是由蚀刻速度和蚀刻时间决定的，而蚀刻速度是受真空度、温度、水蒸汽压所影响。一般蚀刻条件:真空度为133×10-3~133×10-4Pa(10-5~10-6 Torr)，温度降至-100℃，在此条件下，蚀刻速度大约为2nm/s。
4.喷镀即在样品断裂面上喷镀一层铂膜及碳膜。铂膜厚度为2~5nm。为使图像具有立体感，喷铂的方向与样品成45度角。为加固铂膜强度，再喷镀一层碳，喷碳的方向与样品面成90度角。
5.剥离清洗喷镀后，将样品取出放入10~30%次氯酸钠腐蚀液中，样品渐冒气泡并与复型膜分离。随后用蒸馏水仔细清洗复型膜。
6.捞膜将清洗后的复型膜捞在不加支持膜的400目载网上，待干后电镜观察。
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