三、蛋白质的硝化修饰

酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸侧链的硝化与亚硝化作用构成了蛋白质硝化PT M 的主要部分。这些加成反应由发育、氧化应激及衰老过程中产生的活性氮介导。活性氮的增加是由一氧化氮和活性氧的过度反应或调控紊乱造成的（Yeo et al.，2008)。活性氮和活性氧能够靶向于DNA、脂类和蛋白质 (Barnes e ta l.，2003)。根据产生的自由基，活性氮将会优先与酪氨酸残基反应，形成3-硝基酪氨酸或3-亚硝基酪氨酸(Beckman et al.， 19如\ 酪氨酸的硝化修饰的特性也许可通过产生的加合物得到最好的描
述。研究表明，酪氨酸硝化水平的增加与衰老相关的神经退行性疾病有关 ，而且可以作为氧化应激的一个生物标志物(Yeo et al.， 2008)。 在正常生理条件下，硝化酪氨酸加合物的形成会被存在的还原剂, 如谷胱甘肽阻止(C henet al., 2004)。 酪氨酸硝化会将结合的羟基的 PKa 从 10.1改 变 至 7. 2, 并导致被修饰蛋白质结构和功能上的改变(Sokolovsky et al., 1967)

目前没有能够直接分离硝化多肽和蛋白质的选择性富集策略。这 可 能是由于这种PT M 的一氧化氮基团的化学活性较低。在有连二亚硫酸钠（dithionite，DTH)存在的还原环境中，这些相对惰性的部分可被转换成胺类, 从而易于与标签基团反应（Yeo et al.，2008)。随 后 ，标签化的多肽可通过蛋白质组学方法选择性分离和分析。 目前应用最普遍的鉴定蛋白质硝化修饰的方法，是将2I > G E 与某一给定的硝化加合物的特异性抗体的免疫印迹分析结合 (Zhan and Desiderio, 2004)。 蛋白质通过2D —— G E 实验被 解 析 ，并通过适当抗体直观的观察到发生此种修饰的蛋白质。进而将免疫印迹阳性的斑点从胶上切 离 ，消化后利用质谱进行鉴定 (Zhan and Desiderio, 2004) 。 对于酪氨酸硝化修饰，在搜索质谱数据鉴定加合位点时，可根据加合物的不同进行鉴别: 硝化作用产生一个 45 D a 的标称质量漂移，而亚硝化作用产生一个 29 D a 的标称质量漂移。

四、甲基化和 乙 酰 化

赖 氨 酸 和 精 氨 酸 的 甲 基 化 修 饰（+ 14 D a ) 以 及 赖 氨 酸 乙 酰 化 修 饰（+ 4 2 D a ) 这 两 种P T M 类 型 在 组 蛋 白（histone) 密 码 中 的 作 用 正 在 被详 加 分 析 (Jenuwein and Allis, 2001;Strahl and A U i s ，2000)。第 一 次 发 现 与 赖 氨 酸 连 接 的 乙 酰 基 是 在 一 项 对 组 蛋 白 修 饰 的研 究 中 (Jenuwein andAIlis，2001)。组 蛋 白 乙 酰 化 水 平 增 高 通 常 与 基 因 转 录 的 局 部 激 活有 关 (Zhang et al. ，2002)。而 组 蛋 白 赖 氨 酸 甲 基 化 则 集 中 于 被 抑 制 基 因 的 启 动 子 区 域(Berger，2007)。研 究 发 现 ，乙 酰 化 是 动 态 可 逆 的 ，而 甲 基 化 更 稳 定 而 且 「长 寿 」（Bernstein and Allis， 2005)。 尽 管 大 量 研 究 都 集 中 在 这 些 组 蛋 白 上 的 P T M ，但 甲 基 化 和 乙 酰化 修 饰 在 许 多 蛋 白 质 上 都 会 发 生（Glozak et a L ，2005; Grewal and Rice，2004; Sadoul
e t a L , 2008; Y a n g and Seto, 2008)。在 真 核 生 物 中 ，N 端 乙 酰 化 是 最 常 见 的 P T M 之一 ，大 约 8 5 % 真 核 蛋 白 都 会 发 生（Polevoda and S h e r m a n , 2000)。第 一 个 发 现 的 被 乙 酰化 和 去 乙 酰 化 调 节 的 非 组 蛋 白 是 p5 3 蛋 白（G u and Roeder, 1997)。

与 许 多 其 他 P T M — 样 ，传 统 的 鉴 定 甲 基 化 和 乙 酰 化 的 方 法 是 利 用 能 识 别 修 饰 的 特异 性 抗 体 (antibody)。但 是 这 个 方 法 受 限 于 免 疫 方 法 相 关 的 交 叉 反 应 以 及 特 异 性 问 题 。关 于 组 蛋 白 ，有 一 些 从 细 胞 核 中 选 择 性 分 离 的 方 法 (Garcia et al. ， 2007)。 更 通 用 的 鉴 定甲 基 化 和 乙 酰 化 位 点 的 方 法 是 利 用 体 外 放 射 性 标 记 分 析 。这 一 技 术 利 用 了 乙 酰 基 转 移 酶或 甲 基 转 移 酶 来 催 化 加 成 放 射 性 乙 酰 基 或 甲 基 供 体 。薄 层 色 谱 法 (T L C )或 H P L C 分离之 后 进 行 微 量 测 序 ，能 够 揭 示 放 射 性 标 记 氨 基 酸 (Sobel et al. , 1994)。这 种 放 射 性 标 记方 法 有 它 的 缺 陷 ，它 需 要 的 纯 的 起 始 材 料 量 非 常 高 ，并 需 要 使 用 放 射 性 检 测 修 饰 氨基 酸 。

目 前 没 有 一 种 有 效 的 方 法 能 够 选 择 性 富 集 甲 基 化 或 乙 酰 化 修 饰 的 肽 段 或 蛋 白 质 。另外 ，由 于 甲 基 化 和 乙 酰 化 发 生 在 碱 性 残 基 上 ，在 利 用 胰 酶 作 为 蛋 白 酶 时 进 行 酶 切 的 效 率 较低 。尤 其 对 于 甲 基 化 修 饰 这 一 问 题 更 为 严 重 ，因 为 碱 性 残 基 可 能 在 多 个 胺 位 点 发 生 甲 基化 。要 克 服 这 个 问 题 比 较 简 单 的 选 择 就 是 使 用 另 外 的 蛋 白 酶 。然 而 ，丢 失 的 胰 蛋 白 酶 切位 点 也 可 能 给 研 究 者 提 供 了 帮 助 ，它 可 以 作 为 一 个 指 示 以 说 明 该 位 点 可 能 发 生 了 修 饰 。串 联 质 谱 搜 索 算 法 能 够 考 虑 到 乙 酰 化 和 甲 基 化 修 饰 分 别 带 来 的 42 D a 和 14 D a 的平 均 质量 漂 移 和 28 D a 双 甲 基 化 质 量 漂 移 以 及 42 D a 的 三 甲 基 化 质 量 漂 移 。 由 于 三 甲 基 化 和 乙酰 化 肽 之 间 的 质 量 漂 移 仅 相 差 0.0363 D a ，因 此 在 研 究 三 甲 基 化 时 可 能 发 生 错 读 。利用 一 个 质 量 精 确 度 和 分 辨 率 足 够 高 的 质 谱 仪 可 以 分 辨 这 一 质 量 差 异（Zhang et al. ,2 0 0 4 ) 。

另 一 个 鉴 定 乙 酰 化 和 甲 基 化 的 诊 断 工 具 是 分 析 C I D 类 型 质 谱 中 产 生 的 亚 胺（i m m o -n i u m ) 离 子 。含 有 未 修 饰 赖 氨 酸 的 肽 段 通 常 在 8 ½ ¾ ‘ 处 产 生 一 个 特 征 性 的 亚 胺 离 子 峰(Trelle and Jensen, 2007)。当 赖 氨 酸 发 生 修 饰 时 , 会 形 成 一 个 不 同 的 具 有 独 特 W z 值亚胺 离 子（图 40. 3 ) 。受 限 于 发 生 的 重 排 反 应（rearrangement reaction), 无 法 形 成 双 甲 基 或三 甲 基 化 形 式 的 亚 胺 。然 而 ，三 甲 基 形 式 会 产 生 一 个 独 特 的 中 性 丢 失 碎 片 ，与 前 体 相 比 少了 59 D a , 这 是 由 于 丢 失 了 一 个 三 甲 胺 (Zhang et al. ，2004)。图 40. 3 展 示 了 发 生 的 重 排反 应 ，以 及 不 同 亚 胺 离 子 及 其 相 应 的 值 。这些独特 的 鉴 别 特 征 仅 能 通 过 C I D 质产获得。