人类疾病的动物模型-2
三、呼吸系统疾病动物模型的复制
急性呼吸窘迫综合征（RDS）
关于该模型复制方法，除国内外多数采用的油酸法外，尚有静脉注射致死量大肠杆菌内毒素、出血性休克、高浓度氧吸入等等。但目前认为用油酸法制备RDS 模型比较理想，因为这种模型的病理形态及病理生理的改变和临床所见者甚为相似，具有某些临床RDS的特点，可以做为临床研究的对象。从病理上说，注射油酸与临床诱发RDS的因素差异较大；诱发RDS的因素多种多样，表现在肺并无特异性，且本法变化迅速，典型，简便易行，故不失为一种较理想的方法。
油酸是一种毒性很强的脂肪酸，注入后首先通过神经、体液因素使肺微血管强烈收缩。随后，由于脂肪栓子阻塞肺毛细血管，造成肺微循环障碍;油酸尚可直接刺激血管,损伤血管内皮细胞及肺泡上皮，增加通透性，导致间质水肿，出血等病理改变。还有人指出，油酸有破坏肺泡表面活性物质的作用。
取体重2-3kg的家兔，将动物背位固定于实验台上，在2％普鲁卡因局部麻醉下分离一侧颈总动脉以备取血用。待动物安静后观察其一般状态，着重观察呼吸运动、舌粘膜颜色，并记录呼吸频率。由颈总动脉取血1ml(注射针管预先用20mg％肝素盐水冲洗),用丹麦radiomete微量血气分析仪测定PaO2、PCO2、 pH，并计算肺泡－动脉氧分压差（A-aDO2）。用结核菌素注射器从耳缘静脉注射油酸（化学纯，分子量282.47）， 剂量为0.08ml/kg。注射后除观察呼吸频率、呼吸运动等一般变化外，分别于30、60、90、120分钟时取血1ml，重复测定血气及A-aDO2变化，与注射油酸前相比较。注射油酸后3小时将动物放血处死，开胸取肺，用生理盐水冲洗其表面血液，并用滤纸吸去表面水分，然后在普通药物天平上称重，计算肺系数。肉眼观察肺组织大体变化后，将标本用10％中性福尔马林固定液固定，按常规作病理切片镜检。
所有实验动物注射油酸前呼吸频率在40-60次/分之间,注入油酸后10分钟左右最快,可达140/分；2小时后仍保持呼吸过速，但已有减慢趋势。此外动物有明显吸气性呼吸困难，有的在60分钟自鼻腔溢出淡红色泡沫样液体，类似临床急性肺水肿。
注射油酸后血气突出变化是PaO2明显下降，60－120分钟时PaO2比开始下降 30mmHg左右。PCO2与pH值变化不大，但在实验过程中一般可看到初期PCO2 值偏低,pH值偏高，后期则相反，可能与机体代谢情况及呼吸频率变化有关。
注射油酸后肺泡与动脉分压差明显加大。A-aDO2正常值在吸空气条件下为100mmHg,差值加大提示肺泡氧弥漫入动脉血发生障碍，是诊断RDS的重要依据。RDS时因肺水肿、充血、出血等影响通气与血流灌注比率，增加了无效灌注，导致重低氧血症，这种情况不能单纯用提高吸入氧分数(FiO2 )纠正。
A-aDO2计算公式：
动脉血PCO2
A - aDO2 =〔（大气压-水蒸气压）× 吸入气氧浓度－ ──────〕- PaO2 =
呼吸商
40
〔（760-47）× 0.21 - ──〕- PaO2 = 98 - PaO2
0.8
家兔正常组织呈淡红色，表面光滑，实验兔肺组织呈暗褐色，有点状或片状出血、小灶性坏死，多数动物气管内有粉红色泡沫样液体，肺体积增大。曾测定20例实验兔肺系数，平均值为10.41±2.94，明显大于正常值(4-5)，提示有显著肺水肿。
肺重量(g)
肺系数＝──────
体重(kg)
镜检可见部分肺泡呈代偿性扩张，部分肺泡萎陷显示局部不张，肺泡内有水肿液及出血，偶可见有透明膜形成。
应注意必须保证油酸准确注入于血管内,因油酸总量甚微,如稍有外溢则影响很大。处死动物以放血为好。取肺时应将心肺提起，结扎并离断腔静脉及主动脉，并于气管分叉上1mm处再结扎一线，从上端剪断气管，最后连同心肺血管全部结扎离断,务求准确得出肺重量。如此模型作实验治疗用，则可根据实验要求延长动物存活时间或调整油酸剂量。
四、神经系统疾病模型
实验性变态反应性脑脊髓炎
实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE) 是一典型的实验模型。早在1944年Ferraro根据对一系列实验结果的总结，指出EAE和人的脱髓鞘病有相似之处。1947年Freund等报告,以脑或脊髓加Freund佐剂(FA) 进行免疫，仅需一次注射就能引起豚鼠EAE，而且成功率相当高。以后，以兔、小鼠、大鼠、 羊、猫、田鼠及猴等动物用同样方法均能复制成功，以豚鼠最为敏感。这里介绍用同种脊髓加FA进行免疫复制EAE的方法。
Freund氏左剂的制备参照Paterson的制法,液体石腊(c.p)8.5ml，无水羊毛脂(c.p)1.5ml，结核菌。用上述混合液配成4mg/ml的FA。高压灭菌后使用。
脊髓组织悬液：于实验当时，在无菌条件下先将豚鼠肝素化，然后经胸主动脉用生理盐水灌洗至无血。取出脊髓，除去脊膜，称重，用玻璃研磨器将脊髓研成匀浆，以生理盐水配制成50％悬液。
脊髓-FA乳剂的制备：将脊髓组织悬液与FA按1:1混合，用注射器反复抽注，即成乳剂。
选用体重400g左右的豚鼠，于豚鼠的四个足掌肉垫各注射脊髓-FA 0.1ml， 每只豚鼠共注射0.4ml。注射后按常规饲养。
免疫注射半月后，血清中逐渐出现抗脊髓抗体，皮肤试验呈延缓反应，而且豚鼠陆续出现后肢瘫痪，甚至大小便失禁，很易死亡。
血清补体结合反应：由豚鼠心脏抽血，以3，000转/分离心30分钟分离血清。 抗原为1％脊髓生理盐水悬液，也经3，000转/分离心1小时，取其上清液作试验用。补体为2应用单位，溶血系统为2％绵羊红细胞及2单位的溶血素。
皮肤试验：将豚鼠背部剃毛，用10％同种脊髓生理盐水悬液0.1ml作皮内注射， 注后当时及24、48小时观察皮肤反应。本实验在注后当时不见皮肤反应，而在24小时出现红斑或硬结，48小时仍存在，所以是延缓型反应。
组织学检查：在实验终了时处死动物，取出脑及脊髓等欲检查的脏器，福尔马林固定，常规切片、染色作镜检。可见脊膜及中央管周围有明显的淋巴样组织浸润、增厚，脊髓白质内有细胞浸润的小灶状病变及静脉周围呈套袖样浸润。神经细胞有坏死，细胞核消失呈匀质小体，或细胞体消失留下一空隙，以及细胞周围有圆细胞浸润等。在脑组织中可见到脑膜增厚，淋巴样细胞及单核细胞浸润。室管膜及脉络膜亦呈同样变化。小静脉及毛细血管周围，则呈套袖状细胞浸润。脑实质内有小胶质细胞组成的浸润灶。有些星状细胞呈核碎裂、胞浆苍白、细胞变形等。上述变化以脊髓的病理改变和瘫痪最为一致,是最特异的变化，仅见于注射脊髓加FA引起瘫痪的动物。血清抗体虽也有特异性,但与瘫痪或脊髓病变的程度无一致性关系；而皮肤反应则既有特异性，又与瘫痪及脊髓病变呈一致性。文献报导还曾指出，这种模型不能用血清抗体进行传递，但用淋巴细胞被动传递则能成功。提示病变的本质属于细胞免疫机制。至于脑内的变化,特异性较差,用FA或其它组织悬液加FA注射的动物也能发现，唯程度轻的多，可能是FA本身引起的，也可能因为其它组织和脑脊液之间有某些共同抗原性，从而引起交叉反应之故。
五、泌尿系统疾病模型
肾小球肾炎疾病模型
在动物身上建立肾小球肾炎的方法很多，最常用的是通过免疫手段，主要采用的实验动物有大鼠、兔及狗。
以生理盐水配制1:10及1:5鸡蛋白即为抗原。用兔制备抗血清,选体重2kg左右的兔,第一次用1:10鸡蛋白1ml加FA1ml作成的乳剂注射于肌肉内，以后每周腹腔注射一次1:10鸡蛋白2ml，不加佐剂，共注射8次。最后一次注射后5天，心脏穿刺抽血，3000转/分离心30分钟，得血清作沉淀反应。如抗体滴度高就可采血，将血清在56℃灭活30分钟后备用。
于上述血清中加入4倍量1:5-1:10鸡蛋白，以保证抗原处于稍过剩状态， 将溶液混匀即可。
选用体重2kg左右的兔,在实验前4小时，给实验用的健康兔静脉注射1％台盼蓝10ml,以封闭网状内皮系统，实验时由静脉注射上述抗原抗体复合物10ml，注射速度要慢。
注射后2小时，肾脏就开始出现病变,其程度随着时间的推移而逐渐明显。可在不同时间收集动物尿液、血液等进行各种检查。以后将动物处死, 取出肾脏作组织学检查。尿液检查时可发现蛋白、白细胞、红细胞甚至管型,这些改变在注射后一天已经很明显。血中非蛋白氮、肌酐等的浓度也在注射后一天即明显升高。肾脏的组织学检查显示病变呈弥漫性，两侧肾脏均受累。可以发现肾小球毛细血管充血、白细胞渗出，时间稍久者还有由于肾小球内细胞增生而出现肾小球细胞增多、小球体积增大等变化。有些肾小球囊内还可见红细胞、浆液和纤维性渗出物，严重时血管内可有血栓形成。肾小管上皮细胞常有浊肿、玻璃样变等，管腔内含有从肾小球滤过的蛋白、红细胞、白细胞和脱落的上皮细胞，有时它们凝成管型。肾间质内常有不同程度的充血、水肿和少量淋巴细胞及中性粒细胞浸润。动物死亡大约发生在注射后4天或更晚，如能存活2-3天，一般就不致死亡，一周后病变可逐渐恢复。
影响本实验的因素主要是抗体的滴度、抗原和抗体的比例。抗体的滴度要高，抗原量又要比抗体稍多，以致形成的抗原抗体复合物是溶解性的。Dixon的经验指出，肾脏病变呈急性还是呈慢性，与抗体的量及抗原、抗体的相对量有直接关系。抗体量过剩易引起急性肾炎，而抗原抗体量相等时则易引起慢性肾炎。另外，在注射抗原抗体复合物前必须把网状内皮系统充分地封闭，否则就不易成功。如果在注射前用大剂量肝素，则能预防肾炎的发生。
六、内分泌疾病模型
缺碘性甲状腺肿
地方性甲状腺肿除少数地区是由食物高碘和致甲状腺肿物质引起外，主要病因是缺碘。该模型复制方法很多，如用人工配制的低碘饮食饲养动物及用硫尿类和某些磺胺类药物抑制甲状腺组织的过氧化酶以阻碍甲状腺合成。后一种方法致甲状腺肿的机制和低碘性甲状腺肿的发病机制相差很大，不能真实地表现人类甲状腺肿的病理演变，因此在使用上受到一定限制。这里介绍后一方法。
选体重120-150g的Wistar大鼠，饲以含玉米粉46％、大米粉40％、黄豆粉10％、碳酸钙0.5％、氯化钠0.5％、以及少量维生素B粉的食物。此外每周两次饲以去离子水培养的麦芽或稻芽。其中粮食是购自严重地方甲状腺肿病区，磨粉后120℃烘拷24 小时。氯化钠采用分析纯品,经750℃烘烤12小时后使用。自由饮用电阻值2000K Ω以上的去离子水。实验三天后尿碘含量显著减少，并随着实验时间的延长而不断下降。说明低碘饮食3天后大鼠即处于碘饥饿状态。
与对照组相比缺碘17天甲状腺未见肿大，但充血显著，呈暗红色外观。缺碘35天全部甲状腺都显著肿大，充血更明显。随着缺碘时间的延长，肿大加剧，但到了127 天虽然甲状腺肿大，局部充血却减轻。
缺碘早期甲状腺细胞增生活跃，腺组织滤泡增多，腺上皮呈高柱状，并增生形成乳头突入滤泡腔中，滤泡腔内胶质变稀薄，PAS反应减弱。间质充血。过氧化酶联苯胺染色显示过氧化酶活性明显增强。缺碘127天后滤泡上皮高度降低， 含有乳头的滤泡数量减少，滤泡直径增大，胶质含量增加，过氧化酶活性降低等显示甲状腺病理变化由增生性逐步向胶性甲状腺肿转化。
T4值在缺碘35天以后明显降低并持续维持低水平。缺碘后甲状腺 131Ｉ吸收率显著增加且峰值提前，表明大鼠处于碘饥饿中。
缺碘97天以前与对照组相比无差异。缺碘127天重量显著增加。
垂体切片用AT-PAS-OG染色，显示在缺碘35 天后就持续出现促甲状腺素细胞增生肥大，说明在碘饥饿时垂体-甲状腺轴的活动加强。
低碘动物应单独饲养并严格避免含碘药物污染饲养室器皿及空气。沿海地区饲养室的空气应考虑除碘处理。
七、其它疾病的动物模型
多器官功能衰竭（MOF）
1. 新鲜鲩鱼胆汁致大白鼠MOF
(1)实验动物 大鼠，体重200-300g。
(2)器材 鲜鲩鱼胆汁、谷丙转氨酶药盒、胆红素药盒、肌酐药盒、尿素氮药盒、1％戊巴比妥钠溶液、重氮试剂、重铬酸钾溶液、95％乙醇、pH12 磷酸盐－氢氧化钠缓冲液、苦味酸、蒸馏水、尿素氮标准应用液Ⅱ、DAM-TSC液、酸混合液、0.4mol/L NaOH、2,4-二硝基苯肼液、丙酮酸钠标准液、蛋白沉淀剂。大鼠固定器、厚线手套、金属灌胃管、试管、离心管、0.1-10ml吸管、微量加样注射器、721分光光度计、恒温水浴箱、手术器械一套、血气分析仪。
(3)步骤
①用标准吸管吸取鲜鲩鱼胆汁1ml，按比重法测比重并换算成毫升数。
②分别于实验前48小时向甲鼠灌胃380mg/100gb.w 的鲩鱼胆汁和向乙鼠灌以同容量的生理盐水。
③分别用1％戊巴比妥钠35mg/100gb.w进行腹腔内麻醉，并固定于鼠台上。
④手术分离大鼠一侧颈总动脉，取血1ml做血气、 酸碱指标（注意肝素化和隔绝空气）。
⑤切开颈动脉，将切口对准洁净试管口，抬高鼠尾部,向试管接血6ml,用2000转/分离心15分钟，分离血清以备检测SGPT、胆红素、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)。
⑥解剖动物内脏，肉眼观察肝、肾、肺和肠胃的变化。必要时切一小块组织放福尔马林液固定，以备病理切片检查。
2、用内毒素致家兔MOF
(1)实验动物 家兔，体重2-3kg。
(2)实验器材 内毒素、3％戊巴比妥钠、多导记录仪、兔固定台，其它同实验１。
(3)步骤
①取甲乙兔两只，甲兔于耳缘静脉注入0.1％内毒素0.3mg/kgb.w，乙兔则注入同容量生理盐水作为对照。
②将甲乙两兔分别用3％戊巴比妥钠1ml/kgb.w作耳缘静脉注射,麻醉后固定于兔台,分别做气管插管、颈动脉插管，接传感器并连接多导生理记录仪。
③注内毒素或生理盐水后60分钟、240分钟分别记录心率、血压、 呼吸和心电图，另取颈动脉血1ml（注意肝素化和隔绝空气），用血气分析仪检测血气和酸碱指标。
④继续取动脉血6ml，2000转/分,15分钟离心分离血清,检测SGPT、胆红素、BUN 、Cr的变化。
⑤实验结束前用快速放血法处死家兔，游离气管和肺脏，取出全肺计算肺系数。肺系数＝肺湿重(g)/动物体重(kg)。
