细菌学诊断技术（二）
5．核酸探针杂交技术原理
根据完成杂交反应所处介质的不同，分成固相杂交反应和液相杂交反应。固相杂交反应是在固相支持物上完成的杂交反应，如常见的印迹法和菌落杂交法。事先破碎细胞使之释放DNA/RNA然后把裂解获得的DNA/RNA固定在硝基纤维素薄膜上，再加标记探针杂交，依颜色变化确定结果，该法是最原始的探针杂交法容易产生非特异性背景干扰。
液相杂交法指杂交反应在液相中完成，不需固相支持，优点是杂交速度比固相杂交反应速度快5�10倍。缺点是为消除背景干扰必需进行分离以除去加入反应体系中的干扰剂。
分离杂交DNA探针的方法有两种，一种用羟磷灰石，它仅能与双股DNA结合，单股DNA在和羟磷灰石结合前必须先同一个探针或互补单链杂交成双股DNA才可。当溶液中DNA通过羟磷灰石柱子时，只有双股DNA能吸附，然后再把吸附在柱上的DNA洗脱下来，最后用激活的标记物检测。另一种分离方法运用磁球技术把探针与小磁球连接，再用多核苷酸尾部连接第二探针，不用离心就能分离DNA与未杂交DNA。短寡核苷酸能和磁球连接，也能从磁球上洗脱，在以mRNA系统进行靶循环的检测过程中，该方法能将背景干扰降低2---3个数量级，从而达到较高的敏感性。
5．1．夹心杂交法（Sandwish hybridization）
它由三种不同作用的核酸成分组成：（1）：与固相支持物连接的捕获探针；（2）产生信号的检测探针；（3）靶核酸序列。靶核酸在这个体系中起连接捕获探针和信号检测探针的作用。如体系中存在上述三种成分，靶核酸能于上述两种核苷酸杂交，洗脱去除杂质后能得到一个清晰的检测信号，如果靶核酸不与上述两种探针杂交，则信号探针无法连接在固相物上，洗脱后固相物上无信号应答。
5．2．核酸置换杂交分析法 （Strand displacement assay）
它是在夹心杂交法的基础上改进的一种方法。先奖捕获探针连接在固相物上，然后在此探针上以微弱的结合方式杂交一个短小能产生信号的核酸，如果靶DNA能与捕获探针杂交可通过竞争置换出带信号的核苷酸片段，在检测过程中产生信号的单股核酸可转化为ATP，再加入荧光素酶，用生物发光分析法检测。其优点在于背景干扰小，敏感性强。缺点为不是所有捕获探针都能应用这种方法杂交，且信号探针会不断地从捕获探针上脱落。
5．3．浸染棒法 （Dipstick assay）
它是夹心杂交法最新的一种改进方法。它用两种探针，其中一个进行标记，另一个是单核苷酸长链，如多聚腺苷酸。浸染棒上包裹与多聚腺苷酸长链探针能互补配对的碱基成分，即多聚胸腺嘧啶，尽管杂交反应在溶液中完成，但浸染棒是完成最后检测的固相支持物。它比薄膜法能更有效地减少背景干扰，提高检测效率。亦已用于沙门氏菌和李氏菌的检测。对荧光素标记探针可用辣根过氧化物酶标记荧光素抗体，通过比色法检测复合物浓度。
6.聚合酶技术（PCR）的原理及其发展
6．1．PCR技术原理
为提高DNA探针的敏感性，可先将靶DNA序列扩增，增加DNA数量，使其达到足够的检测量，若反应以动力学为基础，则能定量分析。1983年Millus 和Cetus发明了最基本的扩增DNA或增加样品中特殊核苷酸片段数量的方法·聚合酶链反应即PCR法。PCR法建立在三步重复发生反应的基础上。①通过热处理将双股DNA变性裂解成单股DNA；②退火延伸引物至特异性寡核苷酸上；③酶促延伸引物与DNA配对合成模板，引物退火，变性DNA片段，引物杂交形成的模板可参与再次反应。溶液中核苷酸通过酶聚合成相互补对的DNA片段，并能重新裂解成单股DNA，成为下次PCR复制的模板。因此每次循环特异性DNA将以双倍量增加。典型扩增经过20�40次循环能引起100万倍的扩增。在PCR反应中引入Taq聚合酶使反应得以半自动化和简便反应程序。用扩增DNA进行的PCR反应具有无与伦比的优越性。如用同位素标记两种基因（Lac Z 和 Lam B）的，探针做PCR反应检测水源中E.Coli，检测量达到1�5 个细菌/100ml。为快速准确的检测食品中污染的病原微生物带来一线曙光。
当然PCR也存在缺点，主要是系统容易受外源DNA的污染，并随样品中待检DNA一起扩增。特别是1990年Bottger发现某些Taq聚合酶被外源性DNA物质污染。另外试验中需要一定的特殊设备和熟练的操作技术，尚不能全自动化，需要花劳力制备待检样品。
6．2．Qβ复制酶法
Gene-Tark改良了PCR方法，建立了Qβ复酶系统扩增法。这种命名是根据反应过程中起扩增作用的酶来确定的。通过探针与靶DNA相结合，系统以酶学方法促进扩增。该探针是含有一个模板区域的RNA探针，其三级结构称作MDV1。系统含有RNA指导的RNA聚合酶、Qβ和复制酶。扩增MDV-1的速度很快。每循环一次需15-20秒，共循环15-30分钟。千分之一含量的RNA可扩增到125-200ng，一亿倍扩增。由于大量合成RNA，用简单的比色法就能检测杂交反应。反应呈动力学特征，建立标准曲线，确定初始结合物浓度，就可做定量分析。缺点是酶易受污染，导致敏感性下降，背景干扰限制了方法的实际应用。
6.3．连续扩增反应法（Lar）
Lar是在PCR基础上的又一种改进，同PCR不同之处在于它不扩增单个核苷酸形成DNA分子，而是用一种称作T4DNA连接酶把两个寡核苷酸彼此相连。通过连接酶的作用，两者能相互交联，在这种情况下，同PCR反应一样，连结的寡核苷酸沿原始系列排列，并成为下次循环的模板。循环20-30次可把原始靶DNA含量增加100万倍。但它需对整个靶DNA序列事先有明确了解，否则一个碱基错配就会导致寡核苷酸相互连结的失败。
6.4．转录放大系统（TAS/3SR/NASBATM）
1989年Kwoh等介绍了一种新技术，转录扩增系统（TAS），它是包括DNA合成和RNA转录的双重循环过程。它以变性DNA和一般RNA为引物的寡核苷酸靶序列，这个寡核苷酸上包含多聚酶结合部和与靶序列互补配对的片段。杂交时，引物与靶序列结合，反转录酶延伸引物与靶序列互相配对，热变性后，另外一个寡核苷酸退火成新股DNA。再加入反转录酶产生与新股DNA互补的双股DNA。并延伸原始的已退火的引物至另外一个靶序列上。加入RNA聚合酶，可以扩增RNA的拷贝数（10-1000）。因此方法仅需4次循环就能得到RNA分子1,000,000个拷贝数。
1990年Gualelli修正了TAS法，设计了一种称作自我片段复制扩增系统（3SR）。3SR与TAS不同之处在于，3SR是等温反应（37°-42°），需要降解RNA靶序列。如果包括最初变性这一步，3SR方法还是需要扩增DNA，RNaseH用于降解在TAS反应中形成的RNA-DNA杂合物，并转化成双股DNA。在双股DNA的每一末端都含有一个聚合酶结合部，双股DNA继续循环并作为合成RNA的模板，再次参加反应过程。15分钟就能放大100，000个拷贝。而PCR法即使有100%扩增效果也需要85分钟才能取得同样结果。
与PCR相比它不用热循环，因此不必调节反应温度，所有反应在一个反应管中完成。另外3SR能区分DNA和RNA，同其它扩增反应一样，3SR易受外源核酸的污染。由于反应所需的酶多，并且与其它方法相比，反应严格性低，所以特异性较差。
1989年Cangene发明了核酸片段扩增法（NASBMTM），此法已获得欧洲ZL。据报导它能将100个分子的DNA扩增到100ug。
6.5．放大信号检测法
放大信号同时能改善DNA探针的敏感性。有些学者研究处用腺嘌呤酯标志DNA的生物化学检测方法，反应初始时需加入H2O2，酯结构的破坏会产生光，光亮强度与存在的靶DNA含量成比例关系，也有人用一种称作磷酸苯二氧化物做生物发光剂，有报导称，此物质在碱性磷酸酶作用下转化为发光物质，用比色法检测它比OPD和HRP敏感10倍以上。1989年Mclaprae介绍了用化学显影学致敏剂作为标记物，加热后，能释放出光，用固相薄膜检测能增加敏感性，生物化学发光法在DNA探针检测上效果很好。
最近推崇非同位素的标记物是酶标抗体。标记抗体能与共价结合的DNA探针标记物相结合。如在探针尿嘧啶残基上标记荧光素，再用高度亲和力的辣根过氧化物酶标记抗荧光素抗体检测原始探针。胞嘧啶磺化物或在鸟嘌呤上引入2-乙酰氨基荧光素及其衍生物也能替代荧光素和酶连结抗体。
另一种途径是把非活性的S-肽从核糖核酸酶上连结到DNA探针上，杂交后，加入S-蛋白，可重新构建功能酶。再循环酶放大系统中检测活化的核糖核酸酶。
现又研究出一种新方法，它是把探针切成两半，每半标记两种不同的能相互联结的荧光物质或酶系统成分中的一种。当两种探针杂交相互靠近时，激活能量状态的荧光物质转移到邻近的荧光物质或酶系统受体上，而激活受体产生信号。反应过程不用进行分离，因为若没有发生杂交反应，两种成分不能相互靠近，不会产生检测信号。
7.分子生物学技术在食源性病原菌检测上的应用：
7.1.沙门氏菌
食品中沙门氏菌污染量小，常受应激损伤，不易恢复，现用检测方法得到阴性报告最少需四天，阳性报告还要延迟2-3天。研究检测沙门氏菌的探针难度大，因为它拥有2000多个血清型，还不清楚它们是否存在共同特异性的致病因子。Fillal等人从染色体序列和构建的质粒文库中分离到一个适用于沙门氏菌检测的探针。它能和沙门氏菌而不和其他微生物及样品培养基发生非特异性反应。这种用同位素标记的探针，能识别350株不同的沙门氏菌。由于该方法最小检出量只有1个细菌/25克样品，所以需要增菌培养。
AOAC最近认可了Gene-Tark沙门氏菌比色分析法。这种探针标记物为异硫氰酸荧光素（FITC），再用辣根过氧化酶标记抗FITC的抗体结合放大探针，在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶侵染棒固相薄膜上杂交，对239株沙门氏菌的特异性检出率为100%，假阳性率为0.8%（BAM/AOAC培养法假阳性率是2.2%。）
7.2李斯特杆菌
1981年首次确定它是一种食源性病原菌，1985年加尼福利亚发生爆发性流行，现用检测方法大多采用冷增菌，费时费力。
FDA于1987年最新研制出针对李斯特菌致病基因β�溶血素的探针，随后GENE-TARK研制出商品化检测李斯特菌的DNA探针，它能特异性识别细菌的16SrRNA。该探针是由人工合成的寡核苷酸，用比色法检测样品需先在LEB中培养16�22h，然后侵染比色检测，假阴性率为0.8�4.7%（常规法为1.4�2.9%。）
1989年Bessesea等运用扩增李斯特菌溶血素基因中386bp的PCR方法检测单核细胞增生型李斯特菌，DNA检测量低于25ng，即少于1000个菌体，特异性强，能检测出50株不同的单核李斯特菌，而不与12株非单核李斯特菌和12种非李斯特菌属的细菌发生反应。
7.3.弧菌
关于用DNA探针检测溶血性弧菌中溶血基因的报导很多。国外对DNA探针和单克隆抗体法在检测鞭毛抗原方面作了比较，结果发现DNA探针法阳性检出率高。近年来用PCR扩增DNA片段，再做探针检测，能检出新鲜龙虾仁中的弧菌，检测敏感性为10个细菌/克，但要用凝胶电泳进一步鉴定。因此，不太合适检测食品。1989年Olive构建了一个热稳定溶血素基因的寡核苷酸DNA探针检测付溶血弧菌。
7.4.志贺氏菌
目前志贺氏菌检测方法存在着质粒容易丢失和受内源菌干扰的问题。用核酸探针检测可克服上述缺陷。现采用人工合成32P标记的寡核苷酸探针在固定薄膜上做菌落杂交检测志贺氏菌和侵袭性大肠杆菌（EIEC），也有人用PCR扩增技术检测志贺氏菌和（EIEC）。PCR扩增前需将福氏痢疾菌扩增培养到10000个/ml，增菌后检测需6�7小时才能得到结果。敏感性为≤1个细菌/克。但PCR扩增后需做凝胶电泳进一步鉴定，对常规检测来讲太繁琐。
7.5．耶尔森氏菌
Hill等研制出针对同耶尔森氏菌侵袭性质粒有关的DNA探针。用菌落杂交法对人工污染食品所做试验敏感性明显地受内源菌的影响。近年来，有人人工合成了一个24bp的寡核苷酸探针。它是针对侵袭性质粒DNA中一部分的探针，用它检测各种食品中耶尔森氏菌，发现，尽管无法区分无毒菌株且检测限量不理想，但能检测出10000－100000个细菌/克样品。样品中内源性细菌对试验方法没干扰。1989年Feng.P等研制针对由染色体编码的耶尔森氏菌侵袭性基因的DNA探针。
7.6.弯曲杆菌
检测弯曲杆菌的探针是用非放射性物质标记的。标记物为发光素。靶顺序为rRNA。近来用碱性磷酸酶标记人工合成的寡核苷酸检测人工污染的粪便样品，检测量为100000个菌落形成单位（CFU），敏感性和特异性达100%。
探针对空肠弯曲杆菌的最低检测量为20000至800000个活菌。由于粪便成分复杂，影响敏感性，此方法只在临床检测中应用，尚未用于食品检测。
7.7.葡萄球菌
大多数检测葡萄球菌的探针是针对肠毒素的。它们能同编码肠毒素有关的基因序列杂交，这类探针能检测肠毒素A、B、C和E。
最近，GeneTark推出检测金黄色葡萄球菌的探针，能半定量样品中的葡萄球菌，尚未得到AOAC的认可。方法采用侵染棒比色法，探针检测的基因序列是23srRNA。敏感性100%，假阳性率为9.3%，人工污染样品中没有假阳性结果发生。
7.8.假单胞菌属
亦已研制出能检测从肉品中分离到的DNA基因序列相似的假单胞菌的DNA探针。
7.9.大肠杆菌
大肠杆菌是食品和水源污染粪便的指示菌。Gene�Tark研制出用侵染棒检测大肠杆菌中16srRNA的探针。样品需前增菌处理，以异硫氰荧光素（FITC）标记探针，再用辣根过氧化物酶标记抗FITC抗体检测杂交复合物。Hsu等报导方法特异性（除相近的志贺氏菌外）达100%，假阳性率为1.2%（目前使用的BNM/AOAC法为23.4%）。
七十年代人们认识到，E.coli中某些血清型是致病菌，可作为粪便污染的指示菌。用DNA探针检测大肠杆菌肠毒素于1984年得到AOAC的认可。近来研究出用PCR法检测不耐热肠毒素的方法，它可以编码不耐热肠毒素基因序列为引物，用PCR法扩增相应的DNA片段，不扩增耐热肠毒素基因。检测量为20个E.coli/100ul。Sander等构建了一个能检测产生与志贺氏菌毒素相同毒素的大肠杆菌菌株（SLTEC）的探针。增菌后能检测牛肉和其它食品中是否存有SLTEC。1990年Feng.P等研制出大肠杆菌GUD（β�葡萄糖醛酸酶）基因的探针，GUD是AOAC认可的MUG（4�甲基伞形酮�β� D�葡萄糖醛酸），试验中检测的酶，现用PCR法扩增GUD基因，再用DNA探针杂交。MUG试验（即MUG在GUD作用下释放出4�甲基�7�羟香豆素，它在长波紫外光照射下产生兰色荧光）存在的问题是大肠杆菌中发现有MUG阴性分离物，包括大肠杆菌O157：H7血清型的所有菌株，而DNA探针证实GUD基因存在于所有大肠杆菌，包括O157：H7和志贺氏菌菌株中。MUG阴性菌株是由于GUD活性受到分解代谢产物的抑制。Kaspar等报导GUD抗体能和3/4MUG阴性菌株的提取物反应。这表明某些菌株是能产生GUD的，但没有活性，这可能是因为底物无法进入某些菌株细胞内或产物（4�甲基�7�羟香豆素）不能释放到外界中。因此使用GUD探针检测E.coli比MUG试验准确。
7.10.病毒
每年因病毒引起的食物中毒约占2�12%，如1982年Norwalk病毒引起美国5000人患肠胃炎，此外凸隆病毒、柯萨奇病毒、萼状病毒和细小病毒也都能引起爆发性肠胃炎。很久以来人们就发现食品中存在致病性病毒，但对它们的检测方法报导甚少。
食品中病毒检测与临床病毒检测不同。因为每克粪样中约含几千万个病毒粒子，而食品中仅有一个病毒粒子就会引起疾病。尽管如此，要造成对人的危害，尚需摄入成千上万的病毒粒子。为保证人类健康，更精确评价病毒污染食品的程度，只有用DNA探针技术才能实现这一目的。
对市售食品中病毒种类尚缺乏足够的研究，大部分学者只注重对肠道病毒、脊髓灰质炎病毒的研究，其它病毒因方法问题尚未详细报导。即便食品中含有病毒，由于它们数量少，难以从样品中分离和在细胞上复制，实际上低估了食品中病毒的种类。目前的检测方法，需要把病毒沉淀，在细胞和动物上复制验证。DNA探针技术已用于检测凸隆病毒、腺病毒和细小病毒，但还没有用在食品检测上。很难获得足够数量的病毒粒子大大限制了DNA探针技术在检测病毒上的应用。空斑杂交技术缺乏足够的敏感性，而且需事先用PCR扩增DNA片段，它只能用于检测纯培养的病毒。
FDA用合成的DNA探针检测因食用贝类食品引起肠炎患者粪样中的细小病毒，还用DNA探测环境样品中的甲肝病毒。但尚未发现用探针检测Norwalk病毒的报导。
四、病原微生物的自动化系统
近年来，随着计算机技术的不断发展，对病原微生物的鉴定技术朝着微量化、系列化、自动化的方向发展，从而开辟了微生物检测与鉴定的新领域。最有代表性的是AMS微生物自动分析系统。
AMS为美国VITEK厂产品，属于自动化程度高的仪器，由7个部件组成应用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片进行测试，卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质，可用于不同的用途，卡片用后可弃去。
操作时，先制备一定浓度的欲鉴定菌株的菌悬液，然后将菌悬液接种到各种细菌的小卡上，将其放入具有读数功能的孵箱内，每隔一定时间，仪器会自动检测培养基的发酵情况，并换算成能被计算机所接受的生物编码。最后由计算机判定，打印出鉴定结果。
该套系统检测卡片为14种，每一种鉴定卡片要含有25种以上的生化反应指标，基本同常规检测鉴定，检测所需时间4�8小时，最长不超过20小时。
