| 实验步骤 |
一、材料
1. 缓冲液和溶液
乙酸铵（10 mol/L）
氯仿
乙醇
溴化乙锭或 SYBR Gold 染色液
6X 载样缓冲液
LMT 洗脱缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA (pH 8,0)）
酚: 氯仿（1:1，V/V)
平衡饱和酚（pH 8.0)
1X TAE 电泳缓冲液
TE ( pH 8.0)
2. 凝胶
低熔点琼脂糖制备凝胶
3. 核酸和寡核苷酸
DNA 样品
4. 离心机及转子
Sorvall SS-3 或等同转子
5. 专用设备
手提式长波段（302 nm ) 紫外灯
预设温度 65℃ 的水浴
二、方法
1. 用 1X TAE 电泳缓冲液灌制一块含有适当浓度的低熔点琼脂糖凝胶。
所以选择 TAE 而非 TBE 有几个理由。主要是 TBE 中的硼酸盐离子能抑制连接反应，并能干扰从玻璃珠上洗脱下来的 DNA 片段的纯化。
2. 待凝胶冷却至室温后，将凝胶连同支撑用的玻璃板一起移至胶盒的水平表面上。
凝胶也可以放在冷室以保证凝胶充分凝固。
3. 将 DNA 样品与载样缓冲液混合，注入到加样孔中，以 3~6 V/cm 的电压进行电泳。
特定分子质量大小的 DNA 在低熔点琼脂糖凝胶中的泳动速度快于常规琼脂糖凝胶。正因为如此，低熔点琼脂糖所加电压应低于常规琼脂糖凝胶。
4. 如需要，用溴化乙锭或 SYBR Gold 染色液进行染色。用手提式长波（302 nm）紫外灯确定所需条带的确切位置。
5. 用一锋利的刀片或剃刀切下含目的条带的琼脂糖凝胶切片，转移至一个干净的一次性使用的塑料管里。
尽量使切出的琼脂糖切片体积最小，以减少抑制剂对 DNA 的污染量。
6. 切下条带后，进行拍照，从而获得切出条带的记录。
7. 加约 5 倍体积的 LMT 洗脱缓冲液至琼脂糖切片中。盖好管盖，于 65℃ 温育 5 min 熔化凝胶。
8. 待凝胶冷却至室温后，加等体积的平衡酚，将混合液混旋 20 s。在 20℃ 以 4000 g ( Sorvail SS-34 转子 5800 r/min ) 离心 10 min, 回收水相。
9. 再用等体积的酚: 氯仿、氯仿各抽提1次。
10.
水相转移至另一新的离心管中。加 0.2 倍体积的 10 mol/L 乙酸铵和 2 倍体积 4℃ 的无水乙醇。混合液在室温下放置 10
min。然后 4℃，5000 g ( Sorvall SS-34 转子相当于 6500 r/min) 离心 20 min, 沉淀回收 DNA。
11. 用 70% 乙醇清洗沉淀，并溶于适当体积的 TE ( pH 8.0）中。
展开 |
