蛋白质与核酸的紫外交联实验
用溴脱氧尿苷（BrdU)取代的探针进行紫外交联
| 实验方法原理 |
含有胸苷卤代物如溴脱氧尿苷（BrdU)的DNA比非取代的DNA对紫外线诱导的 交联更为敏感。本方案中的紫外交联效率是0.1%〜10%，而且在单一复合物中出现1 次以上交联事件的情况十分罕见。 |
|---|---|
| 实验材料 | 含有所研究结合位点的M13单链载体 |
| 试剂、试剂盒 | 17 bp 的 M13 通用引物 1×和10×限制性内切核酸酶缓冲液 （分别含500μmol L和500 mmol L NaCl） 3000 Ci mmol [α32P] dCTP 50×dNTP BrdU 溶液 0.lmol L 二硫苏糖醇（DTT) |
| 仪器、耗材 | DEAE 膜(Schleicher &- Schuell NA45) 0.5 mL圆底 螺旋盖的小瓶（Nunc或相当产品） 水浴锅 紫外透射仪 |
| 实验步骤 |
1）将10μL含有高亲和性蛋白结合位点的目的序列的单链M13载体与等摩尔的17 bp M13通用引物混合。用1×限制性内切核酸酶缓冲液（50 mmol/L NaCl)将终体积调至100μL。90℃加热5min，在室温下冷却过夜。 2) 将下列反应物加入杂交混合物中： 50μL [α32P] dCTP (3000 Ci/mmol) 3.5μL 50× dNTP/BrdU 溶液 1.75μL 0.1 mol/L 二硫苏糖醇（DTT) 7.5μL 10×限制性内切核酸酶缓冲液（NaCl终浓度50 mmol/L) 7μL H2O 5μL Klenow 酶（25 U) 16℃温育 90 min。 3) 68℃加热 10 min 灭活 Klenow 酶。 4) 在合适条件下，用40U限制性内切核酸酶消化，产生20〜600 bp的DNA片段。 5) 加乙酸铵至0.3 mol/L，用2倍体积的100%乙醇沉淀DNA，重悬于TE缓冲液中。 6) 在含有0.5μg/mL溴化乙锭的琼脂糖凝胶上电泳。用DEAE膜分离所要的DNA片段。 7) 用闪烁计数器检测BrdU取代的DNA片段的特异活性，并用溴化乙锭点迹定量法估计DNA的浓度。 探针的完整性和功能可用迁移率变动DNA结合分析法进行检测。 8) 在1.5 mL圆底小瓶中建立下列结合反应： 105cpm均衡标记的探针、经缓冲的含有结合蛋白的提取液、10~20μg DNA 载体如 poly (dl-dC) • poly (dl-dC)。总体积调至50μL。用塑料薄膜封口，再加封Parafilm膜固定。 9) 将小瓶置于试管架上，用倒置的紫外透射灯（305nm，7000μW/cm2) 在正上方5 cm处照射60 min 10) 在各结合反应管中加入以下反应物： 1μL 0.5 mol/L CaCl2 4μg DNA 酶 I 1U微球菌核酸酶 37℃消化 30 min。 11) 加入等体积的2×SDS样品缓冲液到反应混合物中，100℃煮沸5min。 12) 在适当浓度的不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶上对样品进行电泳,包括14C 标记的蛋白质分子质量标记物。 13) 电泳结束后，切去凝胶前沿的染料。 14) 干胶，并且用增感屏放射自显影1〜3天，以观测交联的蛋白质。
展开 |
| 注意事项 | |
| 其他 |
其他所需试剂：25 U大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，乙酸铵，100%乙醇，TE缓冲液，经缓冲的含有DNA结合蛋白的提取液，大分子载体 DNA，如 poly (dl-dC) • poly (dl-dC)，0.5 mol/L CaCl2，DNA 酶 I (Worthington)，1 U微球菌核酸酶（Worthington)，2×SDS样品缓冲液，Fluor (Du Pont NEN Enhance 或相当物），14C标记的蛋白质分子质量标记物 |
-
焦点事件
