动物血小板线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒产品说明书（中文版）

　　主要用途

　　动物血小板线粒体可溶性总蛋白制备试剂是一种旨在通过低速差速离心和化学渗压休克处理纯化血小板、以及物理或化学破膜和高速差速离心的方法，直接从动物血细胞中分离出完整而纯化的血小板线粒体细胞器，并在蛋白酶抑制混合剂的帮助下，使已纯化的线粒体膜结构破裂而获得线粒体内活性蛋白酶系统的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于人体和各种动物全血（鼠、猪、羊等）中血小板线粒体可溶性总蛋白的制备。可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和营养学等的研究。可直接用于特定蛋白后续纯化、蛋白一维或二维电泳、西方杂交、免疫抗体和质谱分析等等。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定。

　　技术背景

　　线粒体是细胞中重要的细胞器，其主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。线粒体中含有丰富的细胞色素氧化酶系统和细胞凋亡相关蛋白等。通过机械或化学方法破裂细胞，进而差速离心获得线粒体，然后通过特殊裂解液和蛋白酶抑制混合剂防止裂解后线粒体内各种活性蛋白成分遭到活化的内源性蛋白酶的破坏，充分保留线粒体内蛋白质的免疫和生物学活性，最后进行相关蛋白的独立分析。

　　产品内容

　　清理液（Reagent A） 500毫升

　　裂解液（Reagent B） 80毫升

　　净化液（Reagent C） 20毫升

　　强化液（Reagent D） 10毫升

　　保存液（Reagent E） 200毫升

　　破膜液（Reagent F） 2毫升

　　活性液（Reagent G） 20微升

　　上样液（Reagent H） 3毫升

　　产品说明书 1份

　　保存方式

　　保存净化液（Reagent C）和活性液（Reagent G）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

　　用户自备

　　15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

　　50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

　　1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

　　4℃台式离心机：用于样品操作

　　4℃超速离心机：用于样品操作

　　DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞

　　超声仪：用于裂解细胞

　　实验步骤

　　物理处理法

　　实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混匀后，置入冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。

　　准备1个无菌的50毫升锥形离心管

　　轻轻混匀10至20毫升新鲜（2小时内抽取的静脉血）的抗凝全血样品

　　移入到50毫升锥形离心管

　　放进台式离心机离心15分钟，速度为200g

　　小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群

　　用手指轻弹离心管2至3下，使细胞颗粒群松动

　　加入10毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群

　　放进台式离心机离心15分钟，速度为200g

　　小心移取上清液合并到上述50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）

　　放入含有上清液的离心管到台式离心机离心15分钟，速度为200g

　　小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）――此步骤获得血小板富集血清

　　放入含有上清液的离心管到台式离心机离心20分钟，速度为2000g

　　可见白色沉淀颗粒群，小心抽掉上清液

　　加入10毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群

　　放入台式离心机离心20分钟，速度为2000g

　　小心抽去上清液（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）――此步骤获得纯化的血小板

　　加入5毫升预冷的裂解工作液

　　涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群

　　即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆帮匀化细胞（约10下）（注意：参见注意事项11）

　　将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管

　　（选择步骤）置于超声仪枪头下，离心管在冰槽里

　　（选择步骤）超声功率为60％（或150赫兹）猝击10秒，间隙30秒，10个循环

　　放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g

　　小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除未溶解的细胞

　　放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g

　　小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

　　（选择步骤）加入3毫升预冷的保存液（Reagent E）

　　（选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g

　　（选择步骤）小心抽去上清液

　　加入100微升破膜液（Reagent F）到线粒体颗粒样品中

　　加入1微升活性液（Reagent G）

　　涡旋震荡15秒

　　置入冰槽中孵育15分钟

　　涡旋震荡60秒

　　放进微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

　　小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统

　　若暂时不予后续处理，保存在－20℃冰箱里

　　继续进行下列操作：

　　操作一、线粒体总蛋白定量检测

　　1） 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

　　操作二、可溶性线粒体蛋白电泳

　　1） 移取20微升（1微克/微升）上清液到新的1.5毫升离心管

　　2） 加入20微升上样液（Reagent H）

　　3） 涡旋震荡15秒

　　放进微型台式离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

　　煮沸5分钟

　　上样，进行电泳操作和西方杂交

　　化学处理法

　　实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混匀后，置入冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。

　　准备1个无菌的50毫升锥形离心管

　　轻轻混匀10至20毫升新鲜（2小时内抽取的静脉血）的抗凝全血样品

　　移入到50毫升锥形离心管

　　放进台式离心机离心15分钟，速度为200g

　　小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群

　　用手指轻弹离心管2至3下，使细胞颗粒群松动

　　加入10毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群

　　放进台式离心机离心15分钟，速度为200g

　　小心移取上清液合并到上述50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）

　　（选择步骤）放入含有上清液的离心管到台式离心机离心15分钟，速度为200g

　　（选择步骤）小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）――此步骤获得血小板富集血清

　　放入含有上清液的离心管到台式离心机离心20分钟，速度为2000g

　　可见白色沉淀颗粒群，小心抽掉上清液

　　加入10毫升预冷的清理液(Reagent A)，混匀细胞颗粒群

　　放入台式离心机离心20分钟，速度为2000g

　　小心抽去上清液（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）――此步骤获得纯化的血小板

　　入5毫升预冷的裂解工作液

　　涡旋震荡5秒，充分混匀

　　在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次

　　加入500微升预冷的强化液（Reagent D）

　　涡旋震荡5秒，充分混匀

　　在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项12）

　　加入5毫升预冷的保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀

　　放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g

　　小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除未溶解的细胞

　　放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g

　　小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

　　（选择步骤）加入3毫升预冷的保存液（Reagent E）

　　（选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g

　　（选择步骤）小心抽去上清液

　　加入100微升破膜液（Reagent F）到线粒体颗粒样品中

　　加入1微升活性液（Reagent G）

　　涡旋震荡15秒

　　置入冰槽中孵育15分钟

　　涡旋震荡60秒

　　放进微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

　　小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统

　　若暂时不予后续处理，保存在－20℃冰箱里

　　继续进行下列操作：

　　操作一、线粒体总蛋白定量检测

　　1． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

　　操作二、可溶性线粒体蛋白电泳

　　移取20微升（1微克/微升）上清液到新的1.5毫升离心管

　　加入20微升上样液（Reagent H）

　　涡旋震荡15秒

　　放进微型台式离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

　　煮沸5分钟

　　上样，进行电泳操作和西方杂交

　　注意事项

　　本产品为20次（10至20毫升全血）操作

　　其它实际操作的全血容量与试剂使用量按比例调整：例如40毫升全血，试剂用量加倍

　　操作时，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）

　　操作时，须戴手套

　　建议使用新鲜全血：2小时内的全血为理想状态，不要超过24小时

　　全血样品采集须使用全血样品采集须使用EDTA二钾血液抗凝液（12059.1）、ACD血液抗凝液（12059.4），或肝素钠血液抗凝液（12059.5）

　　建议使用足够的样品量

　　血小板提取量因人而异；如果不足，建议增加全血量

　　线粒体操作均须在4℃或以下状态下进行

　　建议严格控制操作时间

　　通常匀化次数为10下（或细胞颗粒群消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数

　　通常孵育5分钟达到80％的细胞裂解为理想状态。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数

　　物理处理法是优先推荐的技术处理

　　通常每毫升全血平均可获得2 X 108血小板

　　通常10毫升全血的血小板线粒体含量为10至25微克线粒体蛋白

　　如果需检测不可溶性线粒体蛋白，可保留线粒体裂解后的沉淀物，直接加入10微升上样液（Reagent H）和10微升无离子水，然后继续操作二的步骤3至6

　　本公司提供系列线粒体试剂产品

　　质量标准

　　本产品经鉴定性能稳定

　　本产品经鉴定无蛋白酶污染

　　本产品经鉴定蛋白萃取产量高

　　本产品经鉴定纯化程度高

　　来源：上海一基实业有限公司

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