关于基因表达系列分析的实验路线的介绍

　　（1） 以biotinylated oligo(dT）为引物反转录合成cDNA，以一种限制性内切酶（锚定酶 Anchoring Enzyme， AE）酶切。锚定酶要求至少在每一种转录物上有一个酶切位点，一般4碱基限制性内切酶能达到这种要求，因为大多数mRNA要长于256碱基（44）。通过链霉抗生物素蛋白珠收集cDNA3′端部分。对每一个mRNA只收集其polyA尾与最近的酶切位点之间的片段。

　　（2） 将cDNA等分为A和B两部分，分别连接接头A或接头B。每一种接头都含有标签酶（Tagging Enzyme TE）酶切位点序列（标签酶是一种Ⅱ类限制酶，它能在距识别位点约20碱基的位置切割DNA双链）。接头的结构为引物A/B序列+标签酶识别位点+锚定酶识别位点。

　　（3） 用标签酶酶切产生连有接头的短cDNA片段（约9～10碱基），混合并连接两个cDNA池的短cDNA片段，构成双标签后，以引物A和B扩增。

　　（4） 用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签（Ditga）片段并克隆、测序。一般每一个克隆最少有10个标签序列，克隆的标签数处于10～50之间。

　　（5） 对标签数据进行处理。在所测序列中的每个标签间以锚定酶序列间隔，锚定酶采用Nia Ⅲ限制性内切酶，则以CATG/GTAC序列确定标签的起始位置和方向。基因表达系列分析（SAGE）示意 锚定酶（AE）和标签酶（TE）是NiaⅢ、FokI X和O分别表示不同标签的核苷酸顺序 由于双标签体的长度基本相同，不会导致扩增的偏态性，同时数量和种类极大的转录物使同一种标签连接成双标签体的可能性极小，这保证了克隆中的每一个标签代表一种转录物在当前细胞状态下的一个单位的转录产物，因此通过计算机软件的分析能够得到上千种基因表达产物的标签序列以及丰裕度。

　　虽然SAGE技术能够尽可能全面地收集生物组织的基因表达信息，但也不能完全保证涵盖所有的低丰度的mRNA。另外标签体的连接可能因接头的干扰造成克隆所包含的标签体过少和克隆序列末端不能高效地连入载体。Powell利用磁性生物素珠特异吸附引物，避免了接头的干扰（Powell 1998）。