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质谱沙龙第十六期活动报道

2009.2.26

2009年2月22日下午，质谱沙龙第十六期活动在第二炮兵总医院远程会诊中心会议室举行。此次到会者除了来自发酵研究院、清华大学医学院、北京大学分析中心、二炮总医院、军事医学科学院、解放军307医院、北京生命科学研究所、中科院植物所、AB公司等老朋友外，还有来自北京大学人民医院、《食品安全质量检测技术》杂志社和《实验与分析》杂志的新朋友。

第十六期质谱沙龙活动现场

AB公司李丹博士

这也是春节过后的第一次活动，大家都怀着饱满的热情前来，AB公司的李丹博士做了简短的发言，预祝2009年质谱沙龙活动举办得更加出色！此次沙龙活动就在轻松活泼的气氛中开始，由第二炮兵总医院药剂科的李鹏飞老师主持。提前赶到的众位朋友们在欢快的音乐声中，观看大屏幕上制作组精心制作的《新春祝福》，在此，也向所有关注沙龙的朋友们献上诚挚的满满的祝福（祝福ppt下载）：

新的一年开始……祝好事接2连3、心情4季如春、生活5颜6色、7彩缤纷、偶尔8点小财、烦恼抛到9宵云外、请接受我10心10意的祝福！

祝新春快乐！

祝您一年开开心心、一生快快乐乐、一世平平安安！

愿您抱着平安、拥着健康、揣着幸福、携着快乐、搂着温馨、带着甜蜜、牵着财运、拽着吉祥、迈入新年！

恭贺新禧！

汇众人之智、攀科学高峰——质谱沙龙回顾

李鹏飞老师首先激情回顾了质谱沙龙前十五期的活动。

2007年9月，质谱沙龙在金秋时节诞生，当时由二炮总医院-质谱检测中心、AB公司、北京师范大学质谱中心/分析中心、北京益科生等发起人讨论了沙龙活动的主旨和举行方式：“纲领”为从事液质联用工作的一线实验人员，互相交流仪器使用和应用方法搭建平台，内容以液相色谱-质谱技术为主，包括医学、药学、食品、保健品、农林牧渔以及基础研究等多种领域。每月召开一次。目前会员约50余人，主要以北京地区为主，包括医院、高校、科研单位、国家机关、相关公司和媒体朋友。形式以报告为主，邀请相关领域的专家学者做报告，研讨为辅，形成自由热烈的交流氛围。会议地点曾经选取在二炮总医院、北京师范大学质谱中心/分析中心、西苑医院、发酵研究院等用户单位。

质谱技术在近年来受到行业用户的广泛关注，质谱的设备保有量逐年增长，质谱的技术发展速度日新月异，应用几乎渗透到有机分析的各个领域。对这种快速增长的新技术，质谱用户之间渴望交流、共同进步的愿望与日俱增。因此，质谱沙龙的创办和坚持，受到了质谱用户们的深深喜爱。一年多来，质谱沙龙引起很多质谱爱好者的关注，每期都有新朋友参加；而从第四期开始，每期活动由“分析测试百科网（www.antpedia.com）”发布报道，使遍布全国和华语圈的更多用户“远程参与”和了解了这个活跃的交流平台。

随后，李老师回顾了沙龙上的报告：前十五期沙龙，从药物研发、临床药代、食品安全、新仪器和试剂新技术新方法等方面做了50多篇专题报道。除了报告和讨论，2008年5月，质谱沙龙还组织了户外活动——“铁血真人CS”，让大家的身心得到更大的放松，也给沙龙增加了更多的欢声笑语。

最后李鹏飞老师预祝2009年质谱沙龙活动有更多的朋友参与进来，集思广益，建立一个更自由、更活跃、更高层次的交流平台。

报告下载：质谱沙龙回顾

8021手性对映体色谱拆分及临床前药代动力学特性比较研究

来自军事医学科学院药代动力学重点实验室的李敬来老师，为大家介绍了题为：《8021手性对映体色谱拆分及临床前药代动力学特性比较研究》的报告。

军事医学科学院药代动力学重点实验室李敬来老师

手性是自然界的普遍特征。构成自然界物质的一些手性分子虽然从原子组成来看是一摸一样，但其空间结构完全不同，它们构成了实物和镜像的关系，也可比喻成左右手的关系，所以叫做手性分子。市场上的绝大多数药物都具有手性中心，研究表明，手性药物的对映体在人体内的药理、代谢过程、毒性和疗效方面可能存在着显著性差异。例如丙氧芬的两种对映体就具有不同的药理作用，一种对映体有治疗作用，另一种则有副作用或毒性；异丙肾上腺素的两个对映体互为拮抗剂；丙胺卡因它的R型对映体经过生物转化以后可以引起高铁血红蛋白血症；普萘洛尔、布洛芬、普罗帕酮等药物都具有代谢动力学的立体选择性…… 从上我们可以看出，开发手性药物的光学异构体，有可能进一步提高疗效，降低毒副作用。因此，单一对映体的开发研究已成为药物研发的热点。

M胆碱能受体是非常重要的药物治疗靶标，存在多个亚性，选择性低、毒副作用大是这类药物研发的主要障碍。药物分子的特异性不仅取决于其独特的化学结构和性质，更取决于其立体的化学结构和性质，所以提高M受体拮抗剂受体的选择性是开发抗胆碱药物的关键所在。8021是该所开发的作用于M受体的手性化合物，它的消旋体作为国家一类新药已被批准上市，经实验验证左旋体表现出比消旋体有更好的抗晕效果，而右旋体无作用，因此该所决定作为一类新药开发它的左旋体。

随后，李老师先介绍了自己所在实验室开展的8021手性对映体药代动力学特性的比较研究。根据SFDA化学药物非临床药代动力学研究的指导原则，如果外消旋体已经上市，开发单一对映体需要满足两点原则：第一点：考察拟开发的对映体是否易被转化为另一对映体；第二点：该对映体单独用药与其作为外消旋体用药时的药代特性是否一致。

而针对该原则，专家组提出了更严格的研究方向：一是确定左旋体和右旋体之间是否相互转化及转化程度如何；二是比较左旋体、右旋体和消旋体三种物质的药代特性的差异。

根据专家组的建议，该实验室建立了在血浆中测定8021手性对映体色谱拆分的实验。

一、先后对以下四种条件进行色谱分析：

空白血浆+左旋体8021（RT 7.7 min）＋内标（标记3个氘的消旋体8021，其中标记的左旋体RT 7.7 min，标记的右旋体RT 9.0 min）
空白血浆+右旋体8021
空白血浆
空白血浆+消旋体8021＋内标

色谱分析显示，在空白血浆的位置没有干扰，方法的特异性比较好。

二、在前面分析的基础上，为证实左旋体和右旋体之间是否相互转化，建立了8021消旋体的质谱色谱拆分方法：比格犬灌胃给8021左旋体，在不同的时间采血然后测定，观察色谱图中右旋体的位置是否出峰，即可判定左旋体是否转化为右旋体。实验结果表明：左旋8021在比格犬体内不会转化为右旋8021。反之，也做了判定右旋体是否转化为左旋体的实验。整个实验结果表示：两者在比格犬体内不会相互转化。

三、接下来通过实验，比较了左旋体、右旋体和消旋体在比格犬体内的药代特性。将六条比格犬随机分成三组，分三个周期依次给它们分别灌胃给药，然后测定药代参数。

第一个实验周期：三组分别给药左旋体、右旋体和消旋体。
经历了一周的洗净期后，在第二个周期：三组分别注射消旋体、左旋体、右旋体。
再经历一周的洗净期后，第三个周期：三组分别注射右旋体、消旋体、和左旋体。

测定方法分为两种：

（1）一种是非拆分的办法，把外消旋体中的左旋8021和右旋8021作为一种物质进行测定，比较左旋体、右旋体和消旋体的药代特性是否一致，测定数据表明左旋体、右旋体和消旋体在比格犬体内的动力学过程基本上是一致的。

（2）另一种是对给消旋体药物的动物，进行手性拆分实验，看看给药后的相互作用。实验结果表明，消旋体给药后，右旋体的峰浓度、AUC都大于左旋体的（即不是1:1的关系）。这说明：由于右旋体的存在导致了左旋体浓度的降低。这非常支持药效学的结果：左旋体药效大于消旋体，右旋体无作用。（即开发左旋体药物是非常有意义的）。举个例子来说，吃1mg左旋体的药物，比吃2mg消旋体的药物，药效要高。原因可能是：右旋体的存在减少了左旋体的吸收，或者增加了左旋体的代谢。

李老师又对8021手性对映体色谱拆分的方法进行了介绍。色谱拆分手性异构体与色谱柱、有机溶剂及其比例、缓冲溶液及其比例、缓冲溶液的浓度、PH值和温度有关。在制定了严格的方法测试流程后，经实验证实，选用蛋白色谱柱，浓度为16%的乙醇有机溶剂，5mmol乙酸铵缓冲溶液，能达到最佳分离效果。

最后简单地介绍了该实验室，军事医学科学院药代动力学重点实验室组建于60年代，十五期间被国家科技部指定为临床前药代与毒代关键技术平台建设单位，获国家“863” 重点项目基金资助。十五期间完成一类创新药的药代报批资料79个，二类47个，近20年来已完成200多项新药药代动力学研究，08年十一五期间获国家“863” 重点项目基金资助滚动资助，获国家重大新药创制基金资助，军科院重点项目资助等。该实验室现有10台液质联用，气质2台，专门用于生物药代分析的毛细管电泳定量PCR仪和配套的放射性同位素设备，HPLC放射检测系统，同位素组织氧化炉等等，并介绍了这些仪器的应用范围和该所的一些科研成果。该实验室有自己的特色，国内最早开展生物技术药物的药代动力学研究，承担国内大部分生物技术药物的药代评价任务；在国内率先采用巨型计算机和 VolSurf 软件预测待合成、筛选化合物的细胞膜透性、P-糖蛋白外排及蛋白质结合等体内转运过程；建立了多种体内、体外药代实验模型和快速评价技术，配合药物设计开展化合物成药性预测；有配套的放射性同位素实验设备，用于研究放射性标记药物的药代动力学与药物分布、排泄；在国内最早应用整体放射自显影研究药物的组织分布。

提问中，在座专家问了一些问题，李老师一一给予解答，并对关于单一对映体开发研究遇到的问题和大家一起进行了探讨。药物代谢动力学在药物研发中的地位越来越重要，它贯穿于药物研发的全过程，军事医学科学院药代动力学重点实验室有一个新药研究多学科群体，为药代动力学研究提供强有力的技术支持，药物研发各个研究阶段应进行多学科间的整体综合讨论，信息相互反馈，相得益彰。药物代谢动力学与各学科之间的关系愈加密切，对指导临床安全合理用药、预防不良反应，了解药物相互作用以及从基因水平上正确指导药物治疗，具有重要意义。

报告下载：8021手性对映体色谱拆分及临床前药代动力学特性比较研究

本网收录前沿Lab：军事医学科学院药代动力学重点实验室

相关链接：手性色谱柱的一些知识

多肽类药物“截短型GLP-1”检测方法相关关键性问题探索

最后由第二炮兵总医院药剂科李鹏飞老师跟大家一起探讨了《多肽类药物“截短型GLP-1”检测方法相关关键性问题探索》的报告。

第二炮兵总医院药剂科李鹏飞老师

讨论的课题是一种多肽类药物的药代，以前尝试用LC/MS方法做临床前药代，但是当时没有成功，只得改用同位素标记的方法；由于今后临床不能用标记的方法，仍需要继续探索该药物的非标记的、特异性方法。这里和大家讨论，一是分享以前摸索的条件，另外也希望大家能提出一些更好的解决思路。编者注：多肽类药物的药代动力学研究是一个热点，也是一个难点。

研究的对象是sGLP-1（截断型胰高血糖素样肽-1），26肽（m/z 2843 Da），它是一种用于治疗II型糖尿病的降糖药。研究证实，它与人体内自身分泌的GLP-1具有同源性且分子量更小，机体不易产生免疫反应，使用更加安全。主要用于Ⅱ型糖尿病的治疗，特别是胰岛素对抗或应用磺酰脲类降糖药无效的患者，对正常血糖不起作用，因而不引起低血糖。

但sGLP-1不适宜用荧光、ELISA方法做药代，所以，主要考虑用HPLC或HPLC/MS方法。

研究的目的是：

1、建立sGLP-1的检测方法；

2、进行药代动力学和毒代动力学研究：包括：基本阐明其在大鼠和猴体内吸收、分布、代谢、排泄的特征；为临床前毒理学研究提供理论依据，并为临床研究提供参考数据。

一、建立HPLC方法

由于26肽分子量较大，多肽还具有空间结构，用LC/MS方法准确定量潜在难度会较大；所以首先建立HPLC定量方法，并且对样品溶解、稳定性、前处理等方面考察。

1、样品的溶解：探索了6种方法，考察是否溶解、溶解后是否稳定、溶解后在HPLC、LC/MS上有好的响应？该药物据委托方说有空间结构，在水里的pH约为3左右，在缓冲体系里能保持空间结构，离开缓冲体系则不能保持。最后选用的溶解方法是：0.01M NaOH溶液溶解样品后，再用0.1M HCl调节PH至5.7的方法。虽然通用的溶解方法，大家希望选用跟后来的流动相（比如乙睛/水）兼容的方法，但是对于这种有空间结构的多肽类药物，仅仅摸索溶解过程，就着实花了不少时间。比如，虽然PBS也能溶，但由于不适用于LC/MS，所以，后来也放弃了。当然，在场做蛋白质组学研究的一些用户也提出了一些建设性的意见。

2、建立标准品的定量工作曲线：用HPLC、紫外215nm，流动相为添加0.85‰～1‰ TFA的乙睛/水体系，标准品的响应是符合要求的，1.25～75μg/ml，每个浓度进5针，R2=0.9996。

3、考察标准液放置的稳定性：分别考察标准溶液在25℃、4℃、-12℃下，新配、24h、48h、72h、一周、两周、一个月的稳定性，测量结果为与原始浓度（50μl/mL）的偏差(%)，证明配置的溶液可在4℃保持两周以上，-12℃保持一个月以上的稳定性。这对于确保今后配置溶液的可靠性很重要，另外可稳定地保存（偏差<15%）也证实了第1步中选用的溶解方法是合适的。

4、前处理方法：

a）首先用超滤方法分离提取，采用了Millipore公司的YM-30与YM-10超滤器从生物样本中进行提取分离，观察12.5μg/ml 标准品溶液分别通过YM-30和YM-10两种超滤器过后的色谱图，但结果不理想：过滤后样品回收率低。超滤器的滤膜为低结合非匀质可再生亲水纤维素膜，可能是由于此膜对药物分子有较多的吸附，而导致的回收率低。当然，在场的老师也提到可试用另一种不是平底的、而是V型的超滤器，会减少对样品的吸附。

b）考虑SPE固相萃取方法，分别一步步地选择活化液、淋洗液、洗脱液，最后确定了流程，并可达到75％的回收率。在生物样品基质的选择中，血浆存在干扰，所以，最终选择了血清。

c）考察药物在生物样品中稳定性：标准品加入血清中室温放置1小时后提取测定，与立即提取无差别。

d）进样稳定性：提取生物样品后立即进样、 2小时、4小时后分别重复进样，三次测定结果无显著性差异，说明进样过程中样品稳定。

50 μg/ml生物样品萃取液相色谱图（基质为血清）

二、建立灵敏度更高的方法——LC/MS/MS

多肽类药物的给药剂量很小，所以必须建立灵敏度高的特异方法，比如要把前面的ug/mL的检测浓度降低到ng/mL级。一个考虑就是LC/MS/MS液相色谱-串联质谱检测法。

在HPLC方法的基础上，用LC/MS/MS串联四极杆质谱仪，分别从质谱参数的优化、色谱条件的优化、生物基质中sGLP-1的提取分离方法这几个方面介绍了HPLC-MS/MS的检测过程。

1、优化质谱参数

选用10μg/mL sGLP-1标准溶液，逐一优化质谱参数，确定母离子质荷比m/z为948.8（带三电荷），二级碎片离子m/z为934.2（定量）和917.2（定性）。

2、优化液相条件，建立标准曲线

a）选择柱子

比较A、B、C三根柱子的响应，保留了A、C柱子继续优化梯度。

测试峰面积与浓度进行1/x加权线性回归计算标准曲线（LC/MS/MS，标准溶液）

b）优化梯度和流速

最后选择了C柱：Zorbax SB-C18柱（4.6×250 mm I.D.，5 μm粒径，300Å孔径），经梯度条件的优化后最后确定流速为0.5 mL/min。

c）定量曲线

初步用优化的条件做1ng/mL～100 ng/mL的曲线，但低点不好，估计是容器（普通的塑料内套管）对药物的吸附作用，所以最后选用了Agilent 100 μL带聚合物支脚的聚丙烯内插管。最后建立了较好的标准品定量曲线：连续三天测定，在1~500 ng/mL的浓度范围内，线性较好。

3、探索前处理方法

在前面液相色谱分析的基础上，对质谱检测中样品的前处理方法进行研究，但结果不理想。因为质谱的灵敏度高，内源性物质的影响就变得非常显著，所以不论选用乙腈或甲醇为沉淀剂的蛋白沉淀法，还是固相萃取法，都在空白血浆（或全血）的药物出峰位置有明显干扰。回收率也比较低。

李老师对实验遇到的各种具体问题还进行了多个方面的分析。但是最关心的当然是：内源性干扰、回收率较低。多肽药代动力学研究很有意义，虽然临床前该药的具体药动实验是用同位素标记法做的，但继续开发非标记的特异、灵敏的方法是今后临床实验中必须要做的。

到场的同行们提了很多建议，做过其它多肽药动方法的同行也抒发了同感。举几个建议如下：

内源性的干扰有时是体内自身产生的，和待测物就是完全相同的物质所以很难消除；
可用MS/MS全扫描二级质谱观看内源性物质的序列，是不是与待测物相同；
可试试二维液相色谱（2D LC）分离
有时可考虑换正相柱子。有时的实验是难以解释的，结果总不好时换柱子，进10针是好的，再进10针就又不行了，还得换柱子（李鹏飞老师说在此实验中，的确换了3根柱子）。
用丙酮沉淀大的蛋白质（sGLP-1不会被沉淀），用V型超滤器等可能会提高回收率
做多肽/生物样品对容器要求较高，不能采用普通的塑料瓶，很有必要采购高价的去活玻璃（树脂玻璃）制成的内插管（或样品瓶）

编者注：生物基质中的多肽药物的药代动力学研究是一个难点，据了解，目前不仅实验室在不断致力于开发新方法，很多公司也在进行该项研究。比如在线的多维SPE系统、进一步增强前处理或分析仪器的选择性、回收率等。

报告下载：多肽类药物“截短型GLP-1”检测方法相关关键性问题探索

本网收录前沿Lab：第二炮兵总医院分析中心

活动后，新参加的用户、其它媒体的朋友对“质谱沙龙”的活动评价是：