单层贴壁细胞-细胞毒性试验-四唑盐（MTT）比色法-实战篇
单层贴壁细胞四唑盐（MTT）比色法
仅供参考 MTT常用浓度为5mg/ml;
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《动物细胞培养--基本技术指南》
注：此书中MTT浓度为50mg/ml
1、药物的细胞毒性
四唑盐（MTT）比色法
操作步骤
接种细胞
（1）用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。
（2）离心细胞悬液,使细胞沉积下来。用培养基重悬细胞，计数。
（3）将细胞稀释至2.5×103-50×103 个/ml,每个微滴定板可容纳20ml细胞重悬液。
（4）用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液，每孔加0.5×103-10×103 个细胞。
（5）将200μl培养基加至第1列和第12列的8个孔中。第1列作读板议的空白对照。
（6）将培养板放至塑料饭盒中，于37℃湿润环境中温育1-3天，等细胞进入指数生长期时可加入药物。
添加药物
（7）用培养基将细胞毒性药物5倍系列稀释，共制备8个浓度。
（8）对于贴壁生长的细胞，去除第2-11列各孔的培养基。
（9）在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基，这些细胞作为对照。
（10）在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物。每个药物浓度仅需4个孔，这样A-D行可用于第一种药物，E-H行用于第二种药物。
（11）向每组4 孔中各加入200μl药物溶液。
（12）将培养板放回塑料盒中，温育至确定时间。
生长期
（13）在药物作用期结束时，去除所有含有细胞的孔中的培养基，加入200μl新鲜的培养基。
（14）每日换液至2-3个PDTs[群体倍增时间]。
存活细胞数的估算
（15）在生长期末，每孔中各加入200μl新鲜的培养基，在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。
（16）用铝箔包裹培养板，于37℃湿润环境中温育4 h。
（17）弃去孔中的培养基和MTT，在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO，以溶解残留的MTT-甲臜结晶。
（18）在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸缓冲液（每孔25μl）。
（19）立即在570nm处记录吸光值。读板仪用第1 列中含培养基和MTT但不含细胞的各孔调零。
分析
以药物浓度为横坐标（X轴），吸光值为纵坐标（Y轴）绘制曲线图。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值，对照组吸光值减少一半时所需的药物浓度为IC50 浓度。
四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，
四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。
无菌材料
生长液；胰蛋白酶（0.25%+EDTA，1mmol/L,溶于PBSA中）；MTT： 3- (4,5) -双甲基 - 2 -噻唑 - (2 ,5) -二甲苯基溴化四氮唑，50mg/ml,滤过除菌; Sorensen 甘氨酸缓冲液（0.1mol/L甘氨酸, 0.1mol/L NaCl,用1mol/L NaOH将PH调至10.5 ）;微滴定板（Linbro,ICN）; 微吸头，最好放在高压灭菌的吸头盒中。
非灭菌材料的准备
塑料盒（无毒的聚苯乙烯，装培养板用）；加样器；DMSO；ELISA读板仪。
体会(更新中)
1、尽管细胞计数很重要，考虑到使用血细胞计数板所测结果的不稳定性，建议不要过分依赖它。将细胞悬液大体计数并稀释后，用微量加样器分装入一96孔板的 几个孔内（旧板亦可），镜下观察细胞密度是否合适。
2、加样时最好使用多道加样器，尽可能减少加样误差。加样时请注意枪头有无气泡产生，避免液体吸入加样器，勤换枪头，频率自己掌握。
