| 实验步骤 |
―、材料与设备
(一）核提取物制备
1) 对数生长期的 HcLa 细胞。
2)PBS：0.2 g/LKCl ，0.2 g/L KH2P04, 8.0 g/LNaCl2.，16 g/L Na2 HPO4.7 H20
以下缓冲液 A、C、D 储存于 4℃，DTT 配成 1mol/L 储存溶液，现用现稀释。
3) 缓冲液 A:10 mmol/LHEPES，4℃ 时 pH7.9, 10 mmol/LKCl, 1.5 mmol/L MgCl2. 0.5 mmol/LDTT。
4) 缓冲液 C:20 mmol/LHEPES，4℃ 时 pH7.9,420 mmol/LNaCl，0.2 mmol/LEDTA,25% 甘油（USP 级），1.5 mmol/LMgCL2，0.5 mmol/LDTT。
5) 缓冲液 D:20 mmol/L,HEPES，4℃ 时 pH7.9 .l00 mmol/LKC1, 0.2 mmo1/L EDTA, 20% 甘油，0.5 mmol/LDTT。
6)MWCO 3500(1 ml/cm) 透析袋（Spectropre)
7)0.04% 台盼蓝
8)Dounce 匀浆器
9)Gorrex 离心管
10）15 mlFalcon 或 Corning 离心管。
(二) 前 mRNA 制备
1) 反应缓冲液：40 mmol/LTris-HCl(pH8.0)，25 mmol/LNaCl, 8 mmol/LMgCl2, 2 mmol/L 精脒
2)280 mmol/L 帽类似物 (m＇G[5＇]ppp[5＇]G，Pharmacia.Picataway，NJ,USA)。
3〕1moL/LDTT。
4)1Ommol/LGTP
5)100 mmol/LUTP、ATP,CTP 溶液
6)[5 H]CTP,30-60Ci/mmol
7) 与所使用启动子相对；的 RNA 聚合酶。
8) 无 RMase 的 DNase
(三）体外加工
1)50 mmol/LMgCl2
2)10% 聚乙烯醇。
3)0.5mol/L 磷酸肌酸。
4)10 mmol/L 四种 GTP、ATP、UTF、CTP
5)25 mmol/LATP
6) 终出缓冲液：50 mmol/LTris-HCl（pH7.4）50 mmol/LEDTA, O.l%SDS
7) 蛋白酶 K
S)10 mmol/LTris-HCl(pH7,4),10 mmoL/LEDTA 饱和酚
9) 氯仿：异戊醇（24:1)
10)1.5mol/LNH4Ac
11)10 mg/ml 酵母 tRNA
12) 乙醇
(四）寡聚 dT 纤维素层析
1)5mol/LNaCL
2) 寡聚 dT 纤维素。
3)TE：10 mmol/LTris-HCl(PH7.4), lmmol/L EDTA
4) 结合缓冲液：TE 十 0.5mol/LNaCl
5) 洗涤缓冲液：TE+0.1mol/LNaCl
6)3mol./LNaAc
7)Econo 层析柱（Bio-Rad,Hercules,CA,USA) 或其他一次件层析装置。
(五）S1 核酸酶分析
1)S1 杂交缓冲液：80% 离子超纯甲酰胺，lOmmol/LPIPES(pH6.1)，0.4mol/LNaCl
2)10mol/ml 经超卢断裂鲑精 DNA。
3)5XS1 消化缓冲液:0.15mol/LNaAc(pH4.5），2mol/LNaCl，5 mmol/LZnSO4
4)S1 核酸酶。
5)40% 丙烯酰胺溶液（丙烯酰胺：业甲双内烯酰胺 19:1）
S) 凝胶上样緩冲液：80% 去离子甲酰胺，0.1% 溴酚蓝，0.1% 二甲苯蓝，lOmmol/LNaOH，1XTBE
7)10XTBE:108 g/LTris 碱，55 g/L 硼酸，9.3 g/LNa2EDTA。
8)X 射线胶片及曝光盒，结果需要定暈的话，则需显像密度计或其他定量测定设备。
9)[32P]dNTPT 3000Ci/mmol, 使用的 dNTP 由探针的序列决定。
1⑴Klenow nDNA 聚合酶
二、操作方法
(1) 核提取物制备
核提取物的制备通常使用 HeLa 细胞，其他细胞系也可以. 制备有效核提取物最关键是在对数生长期收获细胞, 在低温下操作，时间越短越好。一般可采用转瓶培养细胞，这样可以获取人最的提取物，下面所述的操怍方法同样适用于贴壁培养的细胞。
1) 用物理方法或胰酶消化法收荻细胞，于 4℃ 200 g 离心然后用预冷的灭菌 PBS 洗细胞 3 次。
2)
用 5 倍体积缓冲液 A(注意加入 DTT) 重悬细胞注意该步骤及随后的操作都应在低温下逬行)。细胞充分悬浮后在冰上放置 10
min，将细胞转移至预冷的灭菌 Correx 管屮，于 4℃600 g 离心 1Omin. 此时沉淀的细胞体积应该发生膨胀，去除上清，加入 2
倍体积缓冲液 A, 充分悬浮细胞。
3）将混匀的细胞转移到预冷 Dounce 匀浆器，勻浆约 15
次，取少量样品与等量台盼蓝混合以判定细胞裂解情况，在显微镜下观察. 裂解的细胞屮的细胞核能够摄取染料变成蓝色，而完整的细胞则无色。必须保证超过
90% 的细胞裂解，将裂解后的细胞转入预冷的灭菌 Correx 管中，于 4℃1500 g 离心 lOmin, 收集细胞核。
4) 细胞核离心后，去除上淸，对应起始的细胞量，在每 IX109 个细胞中加入 3 ml 缓冲液 C，缓冲液 C 的加入量作常关键。
5) 将沉淀充分混悬后，将核转如匀浆器，匀浆 15 次，样将核转入预冷灭菌的 Falcon 离心管，4°C 于旋转仪上轻轻混匀 lh。
6) 用蒸馏水清洗透析袋，然后浸放在蒸馏水中。同时在灭菌的 2L 烧杯中加入 1L 缓冲液 D(注意加入 DTT)，同时放胃一灭菌搅拌子，置于 4℃。
7)
提取步骤完成后，将含存核的溶液转入预冷灭菌 Correx 管，于 4°C10000 g 离心 30 min. 将上淸转入透析袋并央紧,
将透析袋置于缓冲液 D 中，在冷室屮透析 2-2.5 h，之后将样品分装到干冰冰上的微量离心管中，立即置于一 70°C
保存。采用常规方法测定蛋白浓度。
(二) 采用噬菌体 RNA 聚合酶合成前 mRNA
制备前 mRNA
的质粒含冇能被噬菌体 T7、T3、SP6 等 RNA 聚合酶识別的启动 T 和编码 poly(A)+位点，用限制性内切核酸酶在
3'端加上信号下游处切开质粒从而形成线状 DNA, 用酚和氯仿抽提，乙醇沉淀进行纯化，之后用于转录反应。合成 RNA 时使用的 [32P]UTP
可直接检测转珙产物；如果不用 [32P] 标记的核苷酸，则可利用 [32P」标记的 S1 探针进行检测。下面的法是利用 [3 H] 示踪标记制备前 mRNA，其后加工可以采用 S1 核酸酶分析来进行测定。
1) 在含有 40 mmol/LTris(pH8.0)，25 mmol/LNaCl, 2 mmol/LMgCl2,
2 mmol/L 精脒，2.8 mmol/L 帽类似物，5 mmol/LDTT，5uCi[3
H]UTP,100mol/LGTF,lmmol/LATP、UTP 和 CTP 的叫反应体系屮加入 2ug 线状 DNA 模板和 T7RNA
聚合酶，18℃ 孵育最后加入 2U 无 RNase 的 DNase，于 37℃ 孵育 15 min, 以终止反应.
2) 根据 TCA 沉淀物屮 UTp 掺入量可以确定 RNA 的产量, 该前 mRNA 的加工可利用 3＇端标记的 DNA 探针杂交测定，因此没有必要纯化全长分子。
(三）前 mRNA 加工反应
1) 在含有 2 mmol/LMgCl2,3%
聚乙烯醇，20 mmol/L 磷酸肌酸 ATP,lOOug 核提取物的 50ul 反应体系中加入 2nmol/L(l00fmol) 前
mRNA(每次制备的核提取物的量都需要测定，100ug 通常足够; 前 mRNA 的量也应测定，比较理想的用量为 1-10nmmol/L)
2)30℃ 孵育 2 h
3) 加入等量的终止缓冲液和 30ug 蛋内酶 K,37℃ 孵 15 min, 以终止反应。用酚，氯仿/异戊醇各抽提一次，再加入乙酸铵，25ug 酵母 tRNA 和 2 倍体积乙醇来沉淀 RNA。
4) 当使用 [32P] 标记的 RNA 时，貞接利用凝胶电泳测定产物，如果使用 [3 H]UTP 标记 RNA，在 S1 分析之前需用寡聚 dT 纤维素层析纯化 RNA 产物
(四）转录加工反应
1)501ul 反应体系中，将 1ug 超螺旋 DNA 底物与 100ug 核提取物，3.0% 聚乙烯醇，20 mmol/L 磷酸肌酸,2 mmol/LMgCl2,600 mmol/L 每种 GTF.ATP，UTP 和 CTP,30℃ 孵育 2 h
2) 加入等量的终止缓冲液和 30ug 蛋白酶 K，37℃ 孵育后终止反应。用酚、氯仿/异戊醇各抽提一次，再加入 2.5mol/L 乙酸铵，25ug 酵母 tRNA 和 2 倍体积乙醇来沉淀 RNA，用寡聚 dT 纤维素柱分离纯化 Poly(A)+RNA
(五）寡聚 dT 纤维素柱层析
1) 填装 0.lml 柱床体枳的寡聚 dT 纤维素柱，用 5 倍柱床体积的结合缓冲液平衡层析柱。
2) 将 RNA 溶于 TE, 加热至 60℃ 变性 5 min 后置于冰上，然后在体系屮加入 NaCl 至终浓度为 0.5mol/L, 以防止 RNA 复性，将 RNA 样品上柱，收集流出液体，再重新上柱。
3）用 5 倍体积的结合缓冲液洗杵，收集流出部分，加上上样过程中的流出部分. 即为 Poly(A)+部分，可以丟弃或备用。
4) 用 3 倍体积的含 0.1moL/LNaCL 的 TE 洗柱，弃去洗脱液。
5) 用 3 倍体积 TE 洗脱 Poly(A)+RNA，收集洗脱液
6) 用终浓度 0.3mol/LNaAc 和 2 倍体积乙醇沉淀 RNA。
(六）S1 核酸酶分析加工后的 RNA
1)
用形成突出端的限制件内切核酸酶在多聚 A 位点的上游切开质粒后将其作为 S1 分析的 DNA 探针。用 KlenowDNA 聚合酶和相应的
[32P]dNTP 补平末端，在补平反应前纯化 DNA，但对于大多数酶切反应，可以在酶切完全后直接加入 50-lOOuCi[a-32P] 放射性标的核甘酸（3000Ci/mmol) 和 1UKlenow 酶，在冰上孵育 30 min。标记反应后，用酚和氯仿抽提 DNA，柯用乙醇沉淀，用第二种酶在多聚 A 位点下游切割，利用常规的胶纯化标记的片段。
2) 将沉淀探针和 RNA 溶于 150ulS1 杂交缓冲液中，探针的用量必须根据经验来判足以保证探针的董在反应中超过产物的量。于 90-95℃ 加热混合物然后迅速将管浸入合适温度的水浴中，此时操作必须迅速，确保温度始终不能低于杂交温度，杂交过夜。
3)
制备下列混合物，置于冰上：100ul5×S1 梭酸酶消化缓冲液，35ul 重蒸水，10ug 新变性 (煮 5 min) 的超声打断的鲑鱼精
DNA，250US1 核酸酶（此 S1
核酸酶量通常足以完成反应，但应根据经验进行适当调整），在消化开始前，小心打开含有杂交混合物的反应管，反应管始终置于冰上，将 150ul
冰预冷的消化混合物加入反应管中，立即从水浴中取出反应管，加盖，颠倒数次以混勻，再置于冰上。直到所有反应管处理完毕，然后快速短暂离心，再次将反应管移入加
20-25℃ 水浴中进行消化。如果杂交序列 AT 含量较高，温度也可稍低一些，消化通常在 1-2 h
内完成，但对于不同的探针成根据经验怍出适当调整。
(七）反应产物电泳分析
用聚丙烯酰胺尿素测序胶分离标记的 RNA
或通过 S1 核酸酶分析所得的产物，当使用同位素标记的 RNA 吋，在凝胶上会出现上样 RNA
形成的条带以及迁移较慢的梯带，这些梯带即适被切割以及多聚腺苷酸化的产物，形成梯带是因为 poly(A)+尾长度不一。如果抑制 RNA 加
pdy(A）+尾反应，则在凝胶上. 能观察到 5＇端切除产物的迁移比加入的 RNA 要快。在 S1 核酸酶分析过程中. 出于切割的 RNA
的保护作用，可以发现未消化的探针以及消化产物。
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