多肽的固相合成、切割及纯化（二）
（五）合成结束后处理
小心卸一柱子，倒出肽合成树脂。若切割时，可按切割程序进入，否则将合成肽树脂冷冻干燥后保存。
（六）合成过程的检测报告
1,，资源报告；
2，脱保护图谱；
3，合成过程UV检测图谱
a，脱N端的Fmoc紫外吸收；
b，去Fmoc，洗柱紫外吸收；
c，溶解待合成接上去氨基酸的紫外吸收；
d，偶联氨基酸到柱子上；
e，洗探针的紫外吸收；
f，如果使用延时合成时对检测器冲洗的紫外吸收；
g，洗涤柱子的紫外吸收。
二、合成肽的切割
切割（Cleavage）属于肽合成的后处理部分，是指将已合成的肽从载体（树脂）上切割下来。有人认为也包括脱去侧链保护。切割及去保护是合成中最重要步骤。如果试剂和反应条件选择不当，产物会发生不可逆的修饰而被破坏，因此在切割时应注意以下几个问题：1、选择合适的切割及脱保护试剂，根据合成肽氨基酸的不同而选择；2、选择合适的试剂浓度、反应时间、温度等条件；3、氨基酸侧链的保护，在切割时，切割试剂或切割产物可能对一些对其敏感氨基酸侧链造成破坏或修饰，因此，反应时要选择合适试剂和条件，必要时，对敏感侧链进行保护，使其遭到最小程度的破坏。
（一）切割试剂及条件
试剂配方：TFA/phenyl/water/TIPS=88/5/5/2
条件：
用量 0.5g介质/5ml TFA液
温度 冰浴中
时间 2h
（二）切割操作流程
（三）切割检测
1，茚三酮定性反应，检测介质上huBPP切割是否完全
取4支试管，分别加入①未切割介质；②合成前介质；③已切割介质；④甘氨酸少许，分别加入0.5ml-1ml酸水（<pH3），再加入少许茚三酮，水浴加热，观察颜色变化。氨基酸与茚三酮反应呈紫色。
2，HPLC法：检测切割后肽的纯度
HPLC条件：
仪器：Beckman gold system
色谱柱：DiamonsilTM C18 5μl，250×4.6mm，迪马公司产品
流动相：A: 0.1% TFA
B: 0.1% TFA-CH3CN
洗脱梯度：B: 0~100% 20min
流速：1ml/min
检测波长：245nm
样品准备：取切割后水相液体过0.45μl水性膜，取20μl上样。
结果分析：观察与对照品的保留时间，峰面积百分比等参数。
三、合成肽的纯化
在肽的合成和切割中会产生一不完全肽、反应副产物、残留试剂等，有必要对肽进行纯化。
有关肽的纯化和蛋白质纯化、鉴定有许多相似之处，如均可用色谱纯化，但也在它的特殊性，如分子量太小，不易透析除盐，一般不易用常规SDS-PAGE鉴定等，所以，它的纯化、鉴定应根据肽的特性来设计。HuBPP水溶性好，可以用离子交换色谱如Q-Sepharose FF纯化，平衡液pH选在7.0即可。也可以用反相柱纯化。下面介绍huBPP的反相纯化方法。
（一）仪器及试剂
仪器：Waters 650半制备色谱仪
色谱柱 Prep Park 25×10 Cartridge
内柱：Delta-PakTM C18 100A 15μ
乙腈
（二）纯化过程
样品准备
将切割后水相离心，或过滤除杂，备用
平衡柱子，用H2O平衡柱子，流速3ml/min，到基线平稳
上样，注入5ml样品
洗脱：B液：0~60% 30min
分部收集洗脱峰
（三）鉴定
纯度鉴定：将各峰分别上HPLC反相柱分析，条件见高效液相色谱实验中反相色谱部分。
含量测定及计算收率：用Lorry's 法测定切割、纯化各步骤中的肽含量度计算收率。
