人环磷酸鸟苷酶联免疫试剂盒使用说明（二）
特异性试剂的制备
cGMP AChE示踪液
100dtn cGMP AChE示踪液与6ml的缓冲液
或500 dtn cGMP AChE示踪液与30ml的缓冲液
配制的cGMP示踪液应储存在4℃下，4周内有效
示踪染料：加入染料可辅助目测观察，在配制好的示踪液中加入染料（60ul的染料加入到6ml的示踪液中或是300ul染料和30ml的示踪液）
cGMP抗血清
100dtn cGMP抗血清与6ml的缓冲液
或500 dtn cGMP抗血清与30ml的缓冲液
配制的cGMP抗血清应储存在4℃下，4周内有效
抗血清染料：加入染料可辅助目测观察，在配制好的抗血清中加入染料（60ul的染料加入到6ml的抗血清中或是300ul染料和30ml的抗血清）
无乙酰化的标准品和样品的准备
1ml的缓冲液配制cGMP标准品，终浓度为300 pmol/ml，贮存在4℃下，可保存6周。
标准品准备：准备8个干净试管，标号，吸取900ul缓冲液至1号管，2-8号管加500ul缓冲液，吸取100ul bulk标准品（300 pmol/ml）至1号管，混匀，从1号管吸取500ul至2号管，混匀，依次进行稀释。稀释的标准品贮存时间不能超过24h
如图
样品的准备：如果样品需要纯化，则根据纯化步骤完成，如无需纯化，则无需进一步制备。但是样品需要稀释来确保其浓度保持在标准曲线的线性误差范围内(20%-80%B/Bo)
标准品和样品的准备----乙酰化
标准曲线的准备
用1mlEIA缓冲液重组标准cGMP，吸取100μl标准A到9.9ml的EIA中，此标准品的浓度是3pmol/ml
注意 如果样品利用组织萃取法提取TCA，且不能用至少1:5的EIA来分析，利用乙醚萃取法提取TCA来准备标准曲线。任何稀释的样品需要按此方法进行
用EIA准备标准曲线： 取9个干净试管依次编号#0至#8，吸取900μl到#0（只含有buffer)，#2至#8加入500μlEIAbuffer，吸取1ml标准B（3pmol/ml）到#1 ，然后吸取500μl到#2中稀释，混匀后，从#2中吸取500μl到#3中，混匀，以此类推，至#8，稀释液保存不能超过24小时
样品准备
如果样品需要纯化，则在乙酰化之前进行纯化（操作参照12-14的纯化操作），虽然纯化不是必需的，但我们建议将样品纯化以确保试验的完整性。如果乙酰化的样品少于500μl，必须加入一定体积的KOH，和适量的无水醋酸。
KOH准备
配置4M的KOH溶液，溶解100dtnKOH到10ml的超纯水或者500dtn到50ml的超纯水中
乙酰化步骤（建立在500μl体系中）
#0-#8中所有的标准样品必须乙酰化，每一个样品/标准品都必须单独的乙酰化。确保在同一条件下进行乙酰化是很重要的，混合时间的不同或者是加入KOH的时间有误都会影响试验结果。
500μl的样品，快速加100μl 4M KOH和25μl的无水醋酸，混匀器中混匀15s，加入25μl 4M KOH并混匀，对其余样品重复相同的操作。
注意 如果样品含糖量>250mM，则应该增加合适的KOH和无水醋酸的体积，以确保乙酰化的完全反应。
一般注意事项
检测前样品禁用有机溶剂进行预处理
样品采集后需立即检测,但在-80℃冻存的样品需解冻,不可立即检测.
建议布板如下:
(可根据实验的实际情况调整布局)
注释:每块板条都含用2个空白对照孔(Blk),2个非特异性孔(NSB),2个最大值孔(B0). 8个标准品孔(双份),如下图所示:
实验步骤
A.试剂的加入
1.EIA缓冲液
加100 µl EIA缓冲液到非特异性包被孔中(NSB),加50 µl到最大值孔中(B0).如果加入培养基样品是为了稀释标准曲线的,在非特异性包被孔(NSB)中和最大值孔(B0)加50µl培养基样品,另加50 µl EIA缓冲液至NSB孔中.
2.标准品
加试管#8的50µl标准品至S8孔中.再加试管#7的50µl标准品至S7孔中.依次加入各标准品入相应的孔中.
3.样品
依次加50µl样品于相应各孔中,每个样品至少有两个稀释比例.每个稀释比例都做平行样
4.酶联物
加50µl酶联物于相应各孔中(TA孔和Blk孔除外)
5.cGMP抗血清
加50µl抗血清于相应各孔中(TA孔和NBS孔,Blk孔除外)
微孔 | 缓冲液 | 标准品/样品 | 示踪物 | 抗体 |
Blk | - | - | - | - |
TA | - | - | 5ul | - |
NSB | 100ul | - | 50ul | - |
B0 | 50ul | - | 50ul | 50ul |
Std/Sample | - | 50ul | 50ul | 50ul |
用塑料薄膜(编号:400012)盖板在室温下孵育18h（或在4℃下孵育18h，可些许增加试验灵敏度）
C.试验继续
1.临使用前复溶Ellman’s试剂（20ml的试剂足够加100个试验孔）。1支100dtn的Ellman’s试剂（Cat.400050）用20ml的超纯水复溶。注意：复溶Ellman’s试剂不稳定，只能即配即用且避光储存。
2.弃去反应孔中的反应液，用洗液洗5次。
3.每个反应孔加配制的Ellman’s试剂200ul.
4.加5ul示踪试剂至TA孔内。
5.用塑料胶片盖板，在振荡器上振荡反应60-90分钟，若在4℃，则时间约为90-120分钟。
D.读板
1用干净的纸巾擦去板条底部的指纹.
2移去塑料薄膜,但避免Ellman试剂溅射
3在405-420nm处读数.建议当B0孔的读数在0.3-1.0 AU(减去空白孔后的值)范围时才读取样本值.如果各孔的值超过1.5则应洗板,加入Ellman试剂再孵育
重测.
1. NSB孔的OD均值
2. B0孔的OD均值
3. B0均值减去NSB均值，这就是校正的B0或是校正的最大结合量
4. 计算剩下微孔的%B/B0（%样品或标准品结合量/最大结合量）值，S1的吸收值减去NSB的吸收均值，然后除以校正B0值，乘以100即得到了%B/B0，
按此法重复计算剩余的标准品和样品。
标准曲线的绘制
以标准品的%B/B0值为Y轴和cGMP的浓度为X轴绘制曲线，将数据代入到四参数方程式
计算每一个样品的%B/B0值，根据标准曲线的方程式来计算样品的浓度。样品%B/B0值大于80%或小于20%则视为超出了标准曲线的线性范围，需重做，同一样品的不同稀释比例得到的结果相差甚大，则表明有感染，需纯化。
