高分辨率熔解

在高分辨率熔解仪器HR-1（爱荷华科技，盐湖城，犹他州）上进行分析，将LightCycle毛细管加入HR-1中，0.3℃/s加热。主要的实验中，RET外显子的扩增及非标记探针熔解数据从60℃到95℃采集。主要实验分析了每个外显子的扩增子及探针数据，除了外显子14。因为所有报道的外显子14突变都包含在非标记探针下，只分析了探针数据。第二次实验，只分析了在60℃-89℃采集的非标记探针熔解的数据。

高分辨率熔解数据用之前描述由LabView编写的定制软件分析。简言之，扩增子的熔解曲线数据是规范化的，温度转移之后转换成派生图或荧光差异图。依据用于扩增分析的数据图，由于从野生型对照的视觉偏移的不同曲线形状较宽的派生熔解峰，独特形状的熔解峰（肩峰或两个峰），熔解温度的偏移，和/或荧光不同来检测序列变化。扩增熔解曲线，派生图，荧光不同的图都可以用来检测RET序列变化。非标记探针熔解数据直接转换成派生图。外显子14探针数据标准化，在分析之前指数背景已消除。

在派生熔解峰的1/2出估计非标记探针数据的Tms。杂合样品的△Tms定义为野生型等位基因Tm减去变化（突变，多态性，或序列变化等位基因）等位基因Tm的值。注意：当变化等位基因的Tm值高于野生型的等位基因Tm（例如：和互补的特定突变探针），△Tms的值是否定的。杂合样品的探针数据导致肩峰或平稳形状的峰，峰面积分为1/4，1/2和1/4野生型范围，变化等位基因Tms在这些区域的边界。因为纯合子序列变化（没有野生型等位基因）或变化等位基因Tm值与野生型等位基因Tm值相同时（没有可识别的野生型等位基因）当只有单个峰是显而易见的。之后，野生型对照样品Tm在计算△Tms时用于计算野生型等位基因Tm。野生型样品也会导致单一的峰，所以，从野生型对照Tm减去样品的单个等位基因Tm值。

每个RET序列变化的主要探针△Tm值决定用于第二次基因分型实验的特定突变探针。如果RET突变无法利用（表1），用之前描述的临近的参数估计预计△Tms值。以经验为主的决定和预测RET序列变化的△Tm值与主要探针确定△Tm的范围，期望特定探针选项分组突变。补充表1-5（参阅http://jmd.amjpathol.org）显示△Tm的范围及主要探针分析的突变分组及每个可用的RET序列变化和主要探针及选择的第二个探针的△Tm值。Tm标线放置在派生的平面图，通过从野生型对照等位基因的Tm减去主要实验的△Tm范围计算Tm，如外显子10和11主要探针所示。这些Tm知道方针便于快速、视觉分组突变样品，选择第二次试验的特定突变的探针。但是，计算每个样品的△Tm值可以更好的对照由特定样品的不同引起的系统Tm值的偏移（改变盐的浓度，不同的样品提纯方法或温度不精确）。

盲研究

29个RET突变样品（表1中列出的可用的突变，多态性和序列变化）和5个野生型样品用于生成盲研究。外显子13，14各分析10个样品，外显子11分析20个样品，外显子10分析28个样品（补充表格6， http://www.jmd.amjpathol.org）。每个外显子，野生型样品和变化的样品数目是未知的。盲研究扩增分析，用派生熔解曲线数据的独特的派生峰形状和从野生型对照的Tm移动可以明显的区分序列变化，虽然RET序列变化可以在三种平面图中检测：熔解曲线，派生熔解曲线，荧光信号不同。用WT10A，WT13探针的主要实验的扩增子派生熔解数据分别用来扫描外显子10和13的突变。

从主要实验的每个样品的探针数据计算△Tm值（如果需要，从第二次实验中计算）。△Tm数据表用来决定基因型或从第二次实验中选择特定突变的探针（补充表1-5；http://jmd.amjpathol.org）。表3（补充表1-5的简化版本，http://jmd.amjpathol.org）显示了RET基因分型实验的实验原理图，也可以用于选择第二个探针。Tm标线选择外显子10和11特异突变探针的能力与用计算每个样品的Tm值来选择探针相比较。主要实验之后，样品标记为野生型，外显子13多态性， 外显子16密码子918突变，或其他RET序列变化。检测序列变化的主要探针的△Tm值决定用于第二次基因分型实验的特定突变探针，在RET序列突变的地方进行基因分析。

结果

实验设计

RET外显子10、11、13、14和16的基因分型通过两个步骤完成，闭管实验设计包括主要和次要的实验（表3）。因为用了DNA双链饱和染料，每个反应生成非标记探针和扩增子熔解数据。主要实验包括7个PCR反应和8条探针，用于扫描序列变化和分辨一些基因型（野生外显子，外显子13密码子769多态性和外显子16密码子918突变）。在主要实验中只检测了序列变化但没有基因分型的外显子在第二次实验中用选择的探针进行测试。只用扩增数据检测稀有序列变化的样品（探针下的野生型序列）或在第二次试验中用特定突变探针没有基因分型的稀有序列变化需要通过测序来确定基因型（实验的外显子的~0.2%）。

*RET5个外显子的主要实验中包括了7个PCR反应和8条探针（外显子14是多重的）。列出的主要探针与每个RET外显子相对：WT，野生型；MS，特定突变。主要实验用外显子13密码子769（CTT→CTG）多态和外显子16密码子918（ATG→ACG）的突变的探针及扩增子的熔解数据来区分野生型。从主要实验数据（检测外显子的7%）中的△Tm值选择第二个探针，检测其它的序列变化。有两个例外，样品需要测序（很少）：1）外显子16检测的其它序列变化而不是密码子918突变，或2）主要探针检测的序列变化的△Tm值在选择的第二个探针给定范围之外。这样的话主要探针会检测到两个以上的序列变化或检测到异常序列的变化。

†列出的主要实验的Tm值用于决定样品的基因型或检测在扩增子之内但是不在探针下的稀有序列变化。野生型样品在野生型对照的0.25℃范围之内。

‡ 野生型序列在探针下。调用野生基因型的分析扩增数据或检测在扩增子之内但是不在探针下的稀有序列变化（扩增熔解曲线偏移虽然探针数据显示是野生型）。只用扩增熔解数据检测出来的稀有突变需要测序判断基因型（实验的外显子<0.2）。
§由于突变或普通密码子769多态的序列变化。遮蔽1bp 769探针区别WT13探针检测到的其它序列变化的多态性。

¶用主要实验探针检测外显子的序列变化部分。

‖只有第二次实验的探针用于主要实验检测出来的序列变化的基因分型。根据主要探针与样品的△Tm值选择  探针，形象的用Tm标线（图2a，补充的图1a和2a；http://jmd.amjpathol.org）或计算Tm值（补充表1-5；http://jmd.amjpathol.org）。如果选择的探针不能基因分型序列变化（外显子的0.2%），需要对样品进行测序，例：外显子11（GAC→GAT）多态性。

**位置探针（L）：L10A611遮蔽，L10B620遮蔽，L11634遮蔽分别与主要实验探针WT10A，WT10B和WT11一起使用检测序列变化。