生物芯片（DNA微阵列）荧光扫描仪中的激光共聚...（二）
释放光采集
荧光由目镜的镜头来采集，该镜头聚焦于样品上并将一定区域内的光线收集到装置。收集的角度区域的大小非常关键，荧光释放是球形的，目镜对荧光的采集范围是决定仪器的采集效率关键指标之一。目镜采集光的角度由数值孔径来表示，图2表示了数值孔径与光采集效率之间的变化关系。当数值孔径为1.0时，目镜将收集到整个半球的光，相应的光采集效率为50%。在许多激光共聚焦微阵列扫描仪的数值孔径在 0.5-0.9, 而CCD-扫描仪的数值孔径为0.2-0.5。有其他类型的扫描仪不用目镜而是使用积分球面镜来采集释放的部分光源，但是部分光线经过多次球面反射而衰减。还有一些无散光收集装置，仅仅是将探测器放在样品的某一区域的上方，光线采集的效率受限于样品被照明处的范围及探测器的视角，例如，一个直径为25mm的探测器放在激发点上方100mm处，其实际的有效数值孔径为0.12。图2显示目镜的不同数值孔径与光采集效率的关系。
空间定位
是指对样品上的某一小区域上的荧光信号进行荧光强度计算，微阵列上的各点样品被分割为许多微小的像素，在进行荧光信号定量时，空间分辨率必须高于个点的大小，如微阵列上各点的直径为100mm，则像素的大小为5-20mm。空间定位可通过多元素探测器，如CCD或机械扫描装置。许多相机设置为大范围照明，探测器直接提供由许多像素组成的图象，该方法的缺陷是CCD提供的目镜数值口径较小，后方照明及维持系统冷却设备价值昂贵，由于光散射会导致像素之间交叉重叠造成信号不够清晰。机械扫描过程包括以下几个步骤：将激发光束聚焦于某一大小同像素差不多的点上，用单一元素的探测器采集那一小点上的释放光。要将整个样品扫描完全，则需移动样品或用一微小的反光镜使激光束移动扫描样品。虽然扫描装置增加了机械装置的复杂程度，但比起CCD相机来，机械扫描可达到的数值孔径更高，有更好的空间选择性，探测器也较便宜些。在低强度的光源下，高光线采集率是至关重要的。
激发/释放分辨
微阵列上各点的荧光释放强度通常要比激发光强度弱几个数量级，要从激发光中检测出微弱的荧光信号，就需要对这两种类型的光进行分离，由于光束中的光波长不相同，可利用光波分离将不同的光分开。许多装有目镜的扫描仪采用的是表面照明方式，激发光束与释放光束从样品到目镜经过同样的路径只是方向相反。这种途径使得从样品上反射和散射的光与荧光束混合在一起，所以需要用光束分离器对混合光进行分离。一种类型的光束过滤器是色彩二向或多向过滤器。它将激发光束反射并把释放光束以一较长的波长传输。这种滤光器对一、二或三种不同的激发/释放光都可进行较好的分离，但若超过四种以上的混合光束则分离有困难。另外一种类型的光线分离器称为几何光线分离器，如图3所示，在扫描系统中，目镜的数值孔径为0.6，像素的大小为10mm，从目镜出来的激发光束比释放光束细，一个小反光镜将激光束反射但是让环形部分的释放光束通过，其分离效果与波长光束分离器相同。从理论上来说，光束分离器可以完全将激发和释放光束分开，但实际上并非如此，通常在探测器前放滤光片过滤释放光束。这些滤光片只允许染料的释放高峰附近很窄的一段波长的光通过，而其他波长的光包括激发光都被阻挡了。这是微阵列扫描仪必需的的第二道光束分离装置。有的扫描仪不用光束分离器而是将激发光束和释放光束放在不同的轴上。该方法能将释放光路径的激发光发射回去，但却难以达到较高的数值孔径，因为目镜离样品很近，通常小于1毫米，所以激发光束能进入目镜的角度范围很小。其他具有区分不同波长光束的装置有棱镜、光栅等，这些装置还可产生一些特殊的作用如连续的光波调谐功能。然而，在微阵列中，由于要求对激发光有高度的敏感性，因而对释放光装置也相应要求有很高的精密度。
检测荧光扫描仪的探测器
将微弱的荧光信号转化为电信号,在微阵列扫描仪中的光线探测器有：光电倍增管、CCD点阵探测器、雪崩光电二极管。各种装置有其优点也有其缺点。不同检测范围的仪器要根据它们各自的特点来选择合适的探测装置。光电倍增管在可见光波范围内是最灵敏的探测器，它属于单点探测器并要求扫描系统对微阵列上的样品进行空间定位，通过改变电压可以很方便地改变光电倍增管的灵敏度。光电倍增管的灵敏度在红外及近红外波长范围内降低得很快，所以它们的用途主要限制在可见光波长范围内。CCD对微弱信号的放大功能不及光电倍增管，因而需要额外的放大系统来将信号放大才能达到光电倍增管的灵敏度范围的上限。其主要的缺点是：CCD探测器的实际数值孔径难以达到06-09的范围,在低亮度背景下,限制微弱信号被检测出来,
另外CCD探测器不能与共聚焦系统相兼容;但是在高亮度背景下, 因为CCD探测器有内置式扫描功能,其优越性就体现出来了。
所有的微阵列扫描仪都有固定和放置微阵列固相基质的装置，我们称之为扫描仪的载样盒。载样盒要有能够容纳下玻片的空间，组成其的材料应能经受的住上千次取放样品的刮擦考验。通常微阵列的固体介质为显微载玻片，还有塑料片，但是塑料片不如玻璃片刚硬，容易变形，不易聚焦准确，所以多数研究者使用的是显微载玻片。扫描检测时通常是在室温下进行，此时玻片上各点样品已经干燥，然而，有些染料如FITC在潮湿的环境下才能释放出强烈的荧光，所以研究者们在待测样品上滴加适量的缓冲液，然后盖上盖玻片进行观察。这就需要载样盒能够容纳载玻片与盖玻片叠加之后的厚度，扫描仪在扫描时聚焦于盖玻片下的那一层平面进行扫描。
