Hoxb5细胞的命运我做主将B细胞重编程为功能性T淋巴细胞
小编：天地悠悠过客匆匆潮起又潮落~~~
小鼠甲：咳咳，咱们是个严肃的科普节目……
小编：天地洪荒，宇宙万物，生命起源，又到了万物~~~
小鼠乙：（咆哮体）现在是冬天！冬天！咱们几（今）天要讲的是细胞！细胞！
小编：呃(⊙o⊙)… 好吧，咱们今天要讲的是细胞(*^▽^*)，大家都知道细胞在发育过程中其命运是被严格控制的，以确保每个细胞能以和谐的方式发挥它的生理功能。一些重要的细胞因子参与其中，好像上帝的指令一样，决定了不同细胞的命运，很多科学家也在孜孜不倦的探索其中的奥秘。今天就为大家带来一个关于B细胞重新编程为T细胞的精彩故事^_^且听我慢慢讲来[1] ……
目前已经有很多研究证明通过特定转录因子的表达可以将多能或多能细胞导向分化成特定类型的细胞或从一个谱系转变为另一个谱系。比如Gata1的表达将单核细胞前体转化为红系-巨核细胞和嗜酸性粒细胞[2-4] ，Cebpα将B细胞转化为巨噬细胞[5]； 删除Pax5将B细胞转化为未定型的造血祖细胞[6,7]； Gata3的表达将T淋巴细胞转化为肥大细胞[8]； Cebp±和Spi1的表达将T淋巴细胞转化为巨噬细胞和树突状细胞[9]，Bcl11b的缺失将T淋巴细胞转化为自然杀伤样细胞[10]。但是尝试通过沉默B细胞关键的转录因子，将B转换为T细胞只取得了有限的成功，因为无法在功能上重建整个T细胞谱系，并且在某些情况下，这种操作会增加癌化的风险[6,7,11,12]。但通过以往这些研究，总的来说造血细胞的命运是可以通过基因操作来改变的。
但是到底是哪些转录因子重点参与了细胞间的转化呢？
15个转录因子的异常表达与B细胞重编程为T细胞相关
为了找到这些关键的转录因子，研究人员首先采用RNA-Seq鉴定了成熟完全定型的谱系细胞与Hematopoietic stem cells（HSC）和multipotent progenitors（MPP）中差异表达的转录因子。如果基因在HSC和MPP中的相对表达量比在谱系细胞中高2倍(P< 0.05)，则被指定为在HSC和MPP中差异表达的基因。研究人员筛选出15个在造血干祖细胞高表达的转录因子，它们在HSC和MPP中表达，但未在谱系定型的细胞中表达[图1] ，研究人员推断这些因子在Pro-pre-B细胞中过表达有可能改变该细胞类型的命运。
候选基因初步筛选出来了！我们如何验证这一推断呢？
科学家们将15种转录因子中的每一种克隆到逆转录病毒表达载体中，调整成相同的感染滴度后，混合感染纯化过的Pro-pre-B细胞[图2a]，使感染的Pro-pre-B细胞表达GFP荧光蛋白（TFs），以感染表达GFP空载体的Pro-pre-B细胞为对照（Ctr）[图2b] ，然后移植到清髓预处理的野生型受体小鼠[图2d]。移植后四周，发现部分受体鼠胸腺中出现GFP标记的T淋巴细胞[图2c]。对GFP+胸腺细胞的流式细胞分析显示存在CD44+CD25-CD4-CD8 -DN1、CD44+CD25+ DN2、CD44-CD25+ DN3和CD44-CD25 -DN4的双阴性胸腺细胞（DN），CD4+CD8+双阳性胸腺细胞（DP），CD4+CD8-单阳性T淋巴细胞和CD8+CD4-单阳性T淋巴细胞（SP）[图2e]。
说明这候选的15种转录因子中，存在具有调控B细胞向T细胞转化作用的转录因子。可是这15种候选转录因子中的哪一种诱导B至T细胞转化呢？
Hoxb5的过表达将B细胞重编程为T细胞
为了找到15种候选转录因子中的哪一种诱导B至T细胞转化，研究人员进一步缩小筛选范围。将上述实验中得到得到GFP+胸腺细胞进行单细胞PCR测序，结果发现，这些胸腺细胞大致可以分为这三类病毒来源：1.表达Hoxb5的逆转录病毒（retro-Hoxb5）；2.表达14转录因子但缺乏Hoxb5（14-TF）；3. 只表达GFP的对照的病毒。结果显示，在所有retro-Hoxb5-pro-pre-B细胞受体小鼠（以下称retro-Hoxb5小鼠）中，超过65％的胸腺有核细胞是Ter119-Mac1-CD19-GFP+，而在14-TF或pro-pre-B细胞转移的小鼠中未检测到[图3a]。在移植后4周和8周时，能够在retro-Hoxb5小鼠外周血（PB），脾和淋巴结（LN）中检测到GFP+CD4+和GFP+CD8+成熟T细胞，随后在PB中12周降低和消失[图3b]。GFP+ T细胞包括TCRβ+和TCRγδ+细胞。
此外，研究者从15-TF小鼠中分选GFP+胸腺细胞进行单细胞测序,结果证明上述细胞在单细胞水平同时含有B细胞BCR的Ig重链V(D)J和T细胞TCRβ的V(D)J重组现象 [数据未展示] 。
这些数据表明，Hoxb5有可能是调控B细胞向T细胞转化过程中起关键作用的转录因子。那么我们如何进一步确定这样的结果呢？而且在上述的实验中，Hoxb5的组成型表达是否有影响到T、B细胞的发育呢？
为了排除这些影响，并验证上述实验结果。科研人员构建了一个关键的工具小鼠：Hoxb5LSL/+[图4a]。利用这个小鼠与特异性的Cre小鼠交配，得到两种组织特异性表达Hoxb5（并同时表达EGFP）的小鼠：1. Vav-Cre,Hoxb5LSL/+，造血细胞中特异性表达Hoxb5简称Vav-Hoxb5-GFP小鼠；2.CD19-Cre, Hoxb5LSL/+ ,B细胞中特异性表达Hoxb5简称CD19-Hoxb5-GFP小鼠。首先对这两种小鼠进行基本的流式分析检测，结果显示：1. CD19-Hoxb5-GFP小鼠显示出与来自同窝对照Hoxb5LSL/+相当的发育模式[图4b、c] ；2.与Hoxb5LSL+对照小鼠相比Vav-Hoxb5-GFP小鼠中所有造血细胞，包括T淋巴细胞，小鼠的骨髓和胸腺中的ETP（early T cell progenitors）比例相当 [图4f] 。胸腺中的DN和DP细胞[图4d] ，以及PB，脾，LN和BM中的CD4+和CD8+ T淋巴细胞的比例也相当 [图4e]。
这说明Hoxb5的组成型表达对B、T细胞发育影响都较小。
B细胞特异性表达Hoxb5可以将B细胞重编程为T细胞
对CD19-Hoxb5-GFP小鼠进行分析发现，外周血中约90％的CD19+ B淋巴细胞表达GFP-Hoxb5，而PB中的CD3+ T淋巴细胞或Mac1+骨髓细胞不表达GFP[图5a]。然而在小鼠4w、8w、12w的胸腺中却能检测到GFP+ T淋巴细胞 [图5b] 。
在将CD19-Hoxb5-GFP小鼠BM分离的pro-pre-B细胞移植到经辐照预处理的野生型同品系受体小鼠中。移植后4周胸腺中>30％的T淋巴细胞为GFP+[图5c]，脾脏中>10％的T淋巴细胞[图5d]和LN中的>7％[图5e]是GFP+。 这些结果表明Hoxb5特异性表达将B重编程为T细胞。
仿佛听到Hoxb5在说：你现在虽然是B淋巴细胞，但是只要同时表达了我Hoxb5，不久后你就会变成T细胞哦！厉不厉害？
Hoxb5诱导的T细胞在功能上等同于野生型T细胞
好了，我们已经确定了Hoxb5确实在B细胞向T细胞转化的过程中起关键的作用，那么我们得到再生的T细胞是否是有功能的呢？带着这一问题，我们看看科研人员又做了哪些工作？
为了评估成熟再生的T细胞（iT）的功能，研究者将retro-Hoxb5 pro-pre-B细胞移植到经过亚致死辐射的（3.5Gy）Rag1-/-（C57BL/6背景，缺乏B细胞和T细胞）受体小鼠中。3周后能够在Hoxb5-Rag1-/-小鼠PB中检测到GFP+ iT淋巴细胞[图6a]。将Hoxb5-Rag1-/-小鼠中GFP+脾细胞分离后，体外用CD3和CD28抗体培养6天，检测到各细胞因子比例与野生型比较无差异[图6b、c]。进一步异体皮肤移植模型证明，利用iT细胞重建的Rag1-/-小鼠，能够排斥异体皮肤移植物（BALB/c 背景）。比如在移植部位形成的凸起，溃疡和坏死病变 [图6d] ，免疫荧光实验结果显示同种异体移植皮肤的真皮层能够检测到GFP+CD3+ iT淋巴细胞浸润[图6e]。
iT细胞的功能是否包含获得免疫记忆功能呢？研究人员在异种皮肤移植时隔8周后，对初次皮肤排斥反应的小鼠进行了二次异体皮肤移植。结果表明iT细胞产生了免疫记忆功能，能够在更短地时间内发生免疫应答，排斥二次移植的异体皮肤组织[图7a] 。流式分析排斥的皮肤组织制备的单细胞群发现排斥部位存在浸润激活的CD44higCD69+的CD4+ SP和CD8 SP+ T细胞[图7b] ，并且含有能够分泌INFγ和IL-17的CD4+ SP，以及能够分泌INFγ 的CD8+ SP T细胞[图7c] 。因此，上述重编程再生的T细胞具备获得性免疫记忆功能。
B细胞重编程为T细胞过程中Hoxb5是瞬时表达的
当~当~当……
重点又来啦！！ Hoxb5确实指导了B细胞向T细胞重编程，并且再生的T细胞也具有功能。那么再生的T细胞是否依然需要Hoxb5的表达维持其生理功能呢？
为了研究这一机制，研究人员又构建了条件性诱导表达的Hoxb5小鼠模型(Tet-on Hoxb5-BFP) [图8a]，此小鼠在用DOX诱导下能够表达Hoxb5，停止饲喂DOX则关闭Hoxb5表达。在Tet-Hoxb5小鼠饮用水中添加DOX一周后，在小鼠BM中能检测到BFP+ pro-pre-B细胞[图8c] 。之后将BM BFP+ pro-pre-B细胞转移到辐照过的NOD-SCID小鼠中（以下称为Tet-Hoxb5-NOD-SCID小鼠）并持续饲喂DOX饮水。转移后4,8和12周时检测受体鼠在PB，LN，脾和胸腺都含有供体细胞来源的T细胞[图8d、e]，在转移后4周时检测到超过95％的供体来源的T细胞是BFP-[图8f]。如果Tet-Hoxb5-NOD-SCID小鼠连续喂DOX药水两周后停止喂药[图8b]，则4周后检测发现PB和脾中的所有T淋巴细胞都是BFP -[图8e] 。进一步分析发现BFP+细胞表达Hoxb5，而BFP-细胞与野生型一样不表达Hoxb5 [图8g] 。
这些结果证明体内2周的Hoxb5表达就可以成功地将B细胞重编程为T细胞，之后不再需要Hoxb5持续性表达来维持T淋巴细胞在胸腺的进一步发育成熟。单细胞测序分析表明上述重编程来源的T细胞都含有免疫球蛋白重链VDJ重排序列，证明起源于B细胞[数据不再展示]。
重编程的机制研究：Hoxb5将B细胞转化为ETP
那么，B细胞重编程为T细胞过程中Hoxb5是从哪开始起作用的呢？
研究人员进一步探索重编程中否将pro-pre-B细胞直接重编程为ETP（iETP， early T cell progenitors ）。他们分析了retro-Hoxb5小鼠中BM和胸腺中Lin-CD44+c-kithiCD25 -iETP [图9a]的细胞学动态学。结果显示，在移植后第2周至第6周，在retro-Hoxb5小鼠的BM中检测到GFP+iETP [图9b] ，移植后约3周达到最大丰度。 BM-ETP在转录组学水平显示还残留Pro-pre-B细胞的部分基因表达特征[图9c] 。在胸腺中移植后第4周检测到最大丰度[图9b]，转录组水平显示已经完全关闭Pro-pre-B特异表达基因（如Pax5, EBF1, CD19） [图9c] 。
为了验证胸腺中iETP能够分化为成熟T细胞，研究人员分离了iETP，进行了胸腺内二次移植实验。结果显示ETP可以在受体鼠胸腺发育成熟为CD4+ SP和CD8+ SP T细胞，并且成功分布到脾脏，淋巴结和外周血[图9d] 。因此，Hoxb5是在骨髓中将B细胞重编程为 T淋巴祖细胞（重编程中间态细胞），之后在胸腺中完成重编程，产生有功能的T淋巴祖细胞，再发育产生成熟T细胞。
Hoxb5靶向B、T细胞调节因子和染色质修饰因子
最后，研究人员还通过RNA-Seq和CHIP-Seq实验对比分析了表达Hoxb5和表达GFP对照的Pro-pre-B细胞的转录组和表观组学特征。Hoxb5在pro-pre-B细胞中的表达改变了许多与染色质修饰相关的基因的表达，包括表观遗传修饰因子Hdac9，Ezh1，Ldb1，Cbx8和Asxl1 [图10a]，与B到T细胞重编程过程基因表达模式的改变一致。重要的是，早期B细胞发育所必需的转录因子，如Ebf1，Bcl11a，Foxp1和Foxo1 被Hoxb5抑制，而对T细胞发育或功能至关重要的Nfatc1，Tcf12， Lmo2和Prdm1在pro-pre-B细胞中被Hoxb5激活[图10b] 。
GSEA（Gene set enrichment analysis ）分析表明，与感染空载体相比，retro-Hoxb5 pro-pre-B细胞中对B细胞发育必需的Ikzf1（Ikaros）和Pax5被显着抑制[图10c、d]，而且遗传修饰因子Kmt2a（Mll）（一种对HSC自我更新重要的组蛋白甲基转移酶）也被显著抑制[图10e] 。
这些结果表明，pro-pre-B细胞中Hoxb5的表达抑制B细胞谱系特异性转录因子和特征基因的表达，增强与T细胞发育相关的转录因子和基因的表达，从而实现诱导B细胞到T细胞的命运转化。
好了，总之研究人员揭示了转录因子Hoxb5的表达能够在体内将Pro-pre-B细胞重编程为有生理功能的T细胞。Hoxb5通过抑制B细胞关键转录因子、激活T细胞相关转录因子、调控表观遗传相关分子，从而实现B细胞到T细胞的命运改变。
这时候，仿佛又听到Hoxb5在傲娇的说：单单靠我一个转录因子，在B细胞中维持短短2周的表达，就可以抑制一堆B细胞特异的基因，促进一堆T细胞特异的基因，直接把B细胞变成了T细胞了，而且是记忆力很好的T细胞，有获得性免疫记忆功能哦！我腻不腻害？
故事终于讲完了~~~小编要喝口水~~~接着广告时间到！！！！
大家还记得故事里用到的很重要的工具小鼠吗？ Hoxb5LSL/+ 小鼠（条件性过表达），Tet-on Hoxb5-BFP小鼠（诱导型条件性过表达），他们都是由百奥赛图构建的哦，如果您有基因编辑模式动物的需求欢迎联系我们^_^
