细胞培养污染的来源途径、危害及检测预防措施-2
2.2.1 水
水是唯一一种在凝固时膨胀的化合物。因此在选择冻存细胞的容器时应考虑到这个因素。容器因水的膨胀而发生破裂是引起试剂污染的重要原因。为了避免金属离子、有机分子、细胞内毒素等物质对水的污染，在配制液体，清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水。需要注意的是，超纯水放置过久其纯度会下降。
在高压蒸气灭菌及蒸馏水时水经常被污染，因为高压蒸气锅及纯水机的常规维护后可能有少量的化学物质残留。为了保证水的纯度，我们应采取措施尽量避免化学物质的残留。
2.2.2 血清
动物血清是细胞培养中常用的天然培养基，但血清又是潜在的生物及化学污染的来源。由于血清采集于多个动物，而且不同厂商的生产工艺及质量各不相同，因此血清中许多成分的浓度存在很大的变异。血清对不同细胞的促生长能力及毒副作用取决于这些细胞的分化功能、组织来源及培养基的成分等因素。在进行一系列实验时，为了保证实验的可重复性，最好选用同一批次的血清。
2.2.3 培养液、培养附加成分、试剂 培养液、培养附加成分、试剂都可能成为化学性污染的来源。细胞培养使用的所有物质都应是高纯度的，并经过权威机构的鉴定，实验者本人也应对上述成分进行纯度鉴定。同时，正确配置和储存培养液及试剂也是非常重要的，应该采取标准的操作步骤，避免液体体积计算错误，混用类似化合物等错误。
2.2.4 培养器皿及容器 细胞培养过程中会使用到各种不同的培养器皿及容器。培养器皿的大小，构形设计可能会影响到培养中气体交换、湿度、培养液的
pH值和细胞生长密度。培养器皿的工艺及灭菌过程中的差异可能对培养体系产生影响。塑料制品在生产过程中可能残留一些有毒成形剂，生产工艺的不同可能引起器皿表面附着能力的不同。储存不同物质时应选用合适的塑料或玻璃容器，因为酒精、强酸、强碱能够溶解塑料或玻璃的某些成分。
2.3 生物性污染的来源、危害及预防
外界的微生物如昆虫、节肢动物、原虫、霉菌、病毒、细菌、无细胞壁的微生物(通常指支原体)和其它类型的细胞都可能侵入培养环境引起污染。只要在一个开放的环境中进行培养，都难以避免发生污染。发生污染的可能性取决于操作方法、培养室的无菌环境以及实验室的规章制度。生物性污染对细胞代谢的影响，可因污染源和细胞的种类不同而表现各异。细菌、真菌或其它微生物污染的检测可以用不同培养基进行检查。支原体污染的检测需要特殊的方法。病毒污染的检测可以使用许多体内或体外实验，包括大鼠或小鼠的接种、逆转录酶分析、凝血试验、红细胞吸附试验等。
细菌和真菌的污染较易发现并及时清除，而大多数实验室对支原体的污染缺乏足够的认识。为了防止支原体及其它微生物污染的发生和传播，必须建立规范的无菌操作程序及各种规章制度。支原体归属于柔膜体纲(Mollicutes)的支原体目，它们都具有以下共性:无细胞壁、无细胞壁主要成分―――粘肽的表达。支原体与其它细菌不同之处还在于其胞膜中含有胆固醇或其它甾醇，这种特性使支原体膜更具柔顺性，对于物理因素，如压力、渗透压、脱水的抵抗力很3大。支原体直径仅有013～018μm，并且变形能力大，故能通过滤菌器。需要指出的是，只要有一个具有增殖能力的支原体就能引起培养体系的污染。一旦细胞被污染，支原体的滴度随着时间的延长而逐渐升高，最高可至每毫升10克隆。最为致命的是，即使存在很严重的支原体污染，细胞外观可无明显变化。如果继续使用这种已被支原体污染，而貌似正常的细胞做实验，将会严重影响实验结果。
2.3.1 来源
培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞扩散和传播。细胞被支原体污染后，支原体可以与宿主细胞形成一个共生体系，使污染不断扩大。一旦发生支原体污染，支原体和其它微生物会随着飞沫而不断传播。操作过程中移液，倾倒液体时都会产生具有潜在感染能力的飞沫，并沉积在接触到的表面。这种污染性飞沫能存活数天甚至数星期。此外，操作失误引起的交叉污染也是支原体污染的一个常见途径。人体的组织及体液成分是细胞培养中支原体污染的主要来源。污染的细胞中通常能分离到人类口腔支原体、发酵支原体、唾液支原体以及其它一些与人有关的支原体，如
M.buccale，M.faucium，M.homo2nis，M.pirum和生殖支原体等。无菌操作过程中，操作者能产生有污染性的随空气传播的飞沫和微粒，造成培养体系的污染。人体外周血、骨髓、淋巴组织原代培养中有可能发生发酵支原体的原发污染(primarycontamination)，这也证明支原体在分化细胞中较未分化细胞更易生长。随着培养技术的不断发展，人们已能培养来自不同物种如动物、植物、昆虫的各种细胞，同时也扩大了支原体及其它微生物的宿主范围。此外，某些支原体，如菜氏无胆甾原体科(Acholeplasmalaidlawii)、M.arginini、
M.hyorhinis、口腔支原体、唾液支原体能寄生不同的宿主，并能在培养体系中稳定增殖数年。牛血清中能分离到A.laidlawii、
M.arginini和M.hyorhinis支原体，因此血清可能成为支原体污染的来源。由于无血清培养基中许多附加成分及试剂是从血清或其它生物制品中制备的，因此无血清培养体系并不能排除支原体污染的危险。尽管随着培养技术的进步，血清发生污染的可能性进一步降低，但只要有一个活的支原体能通过滤菌器，整个培养体系就会被污染。
2.3.2 危害
支原体通过产生代谢产物及消耗各种养分，如核酸前体及必需氨基酸，从而改变细胞的代谢状态。支原体可以酵解糖，分解精氨酸，氧化丙酮酸，解脲支原体可以利用尿素作为能源，这会使细胞代谢发生一系列改变，从而影响蛋白质、DAN、RNA合成以及嘌呤从头合成及补偿合成途径。污染时间的长短及核酸代谢改变决定了支原体污染造成的危害程度，导致细胞染色体断裂、重排、非整倍体的出现。随后，细胞的生长特性发生改变，使某些酶和细胞因子的产生增加，并表现出一些特殊的细胞功能，而其它一些细胞正常的功能则被抑制。某些支原体附着在细胞表面后，会与宿主细胞交换膜抗原成分。随着细胞膜成分的改变，细胞的形态及抗原性发生改变。细胞污染对研究工作带来的最大危害是由于错误的实验结果导致研究误入歧途。此外，支原体污染还会干扰细胞的筛选，如杂交瘤细胞生长受到抑制并丧失产生单抗的能力
